Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, tek taraflı üreter tıkanıklığının adım adım, tekrarlanabilir bir modelini tanımlamaktadır.

Özet

Tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO), kronik böbrek hastalığının (KBH) yaygın bir nedenidir ve renal interstisyel fibrozun ilerlemesine ve sonuçta geri dönüşü olmayan böbrek hasarına yol açar. UUO'nun hafifletilmesi çok önemlidir. Literatürde, üreter tıkanıklığının giderilmesini takiben fizyolojik ve patofizyolojik değişiklikleri simüle ederken yapısal değişikliklerin ve fonksiyonel hasarın gözlemlenmesini sağlayan geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığının (RUUO) çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bu çalışmada, silikon tüp kullanılarak tek taraflı murin üreterinde geri dönüşümlü bir obstrüksiyon modeli oluşturulmuştur. Tıkanıklık giderilmeden önce önemli böbrek hasarı gözlendi ve daha sonra kısmi iyileşme kaydedildi. UUO'dan farklı olarak, bu model ilerleyici hidronefrozu önleyerek farklı patolojik sonuçlara yol açar. Bu basit cerrahi prosedür yüksek bir başarı oranı göstermektedir ve renal interstisyel fibrozis için geri dönüşümlü obstrüktif nefropati ve potansiyel tedavileri araştırmak için klasik bir model olarak umut vaat etmektedir. Ayrıca, obstrüktif nefropatiden iyileşme mekanizmalarını, renal hücre rejenerasyonunu ve doku yeniden şekillenmesini incelemek için pratik bir platform sağlar.

Giriş

Üretral tıkanıklık, renal interstisyel fibroz ve kronik böbrek hastalığına (KBH) önemli ölçüde katkıda bulunur ve potansiyel olarak böbrekte geri dönüşü olmayan yapısal hasara ve fonksiyonel bozukluklara yol açar1. Tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO), böbrek hasarı ve KBH'yi incelemek için yaygın olarak kullanılsa da, bir tıkanıklığın giderilmesinden sonra ortaya çıkan spontan iyileşme mekanizmalarını doğru bir şekilde tekrarlamaz. UUO modeli, sol üreterin dikişlerle bağlanmasını içerir, bu da kalıcı tıkanıklık, üreter genişlemesi, hidronefroz, renal parankimin sıkışması ve kortikal incelme ile sonuçlanır. Histolojik inceleme tipik olarak tübüler dilatasyon, tübüler epitel hücre nekrozu ve ilerleyici interstisyel inflamasyon ve fibroz2'yi ortaya çıkarır. Bu model öncelikle renal interstisyel fibrozisis ve persistan obstrüksiyona bağlı geri dönüşümsüz böbrek fonksiyon kayıplarını araştırır.

Bununla birlikte, üreter taşının neden olduğu tıkanıklık veya tümörler gibi klinik pratikte karşılaşılan birçok böbrek hastalığı geri dönüşümlüdür. Geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığı (RUUO) modeli, böbrek yapısının ve idrar yolu fonksiyonunun kısmi restorasyonuna izin vererek sonuçta hidronefrozu çözer. İyileşme, böbrek hasarı ve fibrozdaki azalmayı ölçmek için görüntüleme teknikleri, histolojik inceleme ve biyobelirteç analizi ile değerlendirilebilir3. Bu model, klinik ortamlarda obstrüktif nefropatinin iyileşme aşamasını yakından taklit eder ve iltihaplanma, bağışıklık tepkileri, hücre yenilenmesi ve doku yeniden şekillenmesi gibi temel süreçleri incelemek için UUO'dan daha uygundur 4,5,6,7,8.

RUUO modeli, araştırmacıların dinamik çalışmalarda UUO'nun sınırlamalarını ele alarak, yaralanmanın giderilmesini takiben böbrek onarımını ve rejenerasyonunu analiz etmelerini sağlar. Araştırmacılar, tıkanıklıktan önceki ve sonraki farklı zaman noktalarını karşılaştırarak, iltihaplanma, apoptoz, fibroz ve rejenerasyon dahil olmak üzere yaralanma ve onarımla ilgili moleküler yolları araştırabilirler. Bu yaklaşım, renal iyileşme mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirir ve potansiyel terapötik hedefleri tanımlar 2,3,4,5,8,9,10. Renal fibroz genellikle geri dönüşümsüz olarak kabul edilirken, klinik gözlemler, ilk fibroz aşamalarında tıkanıklığın erken rahatlamasının hastalığın ilerlemesini durdurabileceğini veya hatta tersine çevirebileceğini düşündürmektedir. RUUO modeli, bu fenomeni araştırmak için değerli bir deneysel platform sağlar11.

Ayrıca, RUUO modeli, tıkanıklığın giderilmesini takiben fibrozun tersine çevrilmesinin incelenmesini kolaylaştırır, iyileşme mekanizmaları ve potansiyel antifibrotik tedaviler hakkında bilgi verir 3,4. Sonuç olarak, bu model translasyonel araştırma için oldukça pratiktir. Bu deneysel modelin birincil amacı, üreteral kanülasyon yoluyla obstrüktif nefropatiyi indüklemek ve ardından tutarlılığı sağlamak için önceden tanımlanmış bir zaman noktasında standartlaştırılmış rahatlama sağlamaktır. Basitlik, tekrarlanabilirlik ve güvenlik için optimize edilmiştir ve bu da onu deneysel araştırmalar için etkili bir araç haline getirir.

Protokol

Bu hayvan çalışması, Helsinki Bildirgesi'nin yönergelerine bağlı kaldı ve Chongqing Tıp Üniversitesi Çocuk Hastanesi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı. Toplam 27 erkek Sprague Dawley (SD) sıçanı ticari olarak elde edildi ve Chongqing Tıp Üniversitesi Çocuk Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nde barındırıldı (SPF, lisans numarası: SYXK (Chongqing) 2007-0016). Sıçanlar, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü ile kontrollü sıcaklık koşulları altında tutuldu ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi vardı.

Protokol, 6-8 haftalık erkek SD sıçanlar üzerinde gerçekleştirildi ve bilateral üreterleri olan her yaştan sıçanlara uygulanabilir. Bu çalışmada, on beş adet 6 haftalık erkek SD sıçan rastgele üç gruba ayrıldı: yerli grup (n = 5), UUO grubu (n = 5) ve RUUO grubu (n = 5). Ek olarak, beş adet 8 haftalık SD sıçan (n = 5) ek bir kontrol grubu olarak dahil edildi. RUUO modelini oluşturmak için 12 sıçan kullanıldı ve intraoperatif ve postoperatif mortalite, cerrahi başarısızlıklar, eksik tıkanıklık ve başarısız geri dönüş gibi potansiyel riskleri hesaba katmak için 7 ek sıçan tedarik edildi. Bu, sonraki analizler için grup başına en az 5 sıçan sağladı.

Tüm cerrahi prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal yönergelere sıkı sıkıya bağlı kalınarak yürütülmüştür. Cerrahi personel, cerrahi maskeler, eldivenler ve önlükler dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (KKD) protokollerine bağlı kaldı. Her prosedür için steril cerrahi aletler kullanıldı ve steriliteyi korumak için kullanımdan önce ve sonra otoklavlandı. Kesici aletler ve biyolojik numuneler de dahil olmak üzere atık malzemeler, kontaminasyon risklerini azaltmak ve güvenliği sağlamak için tehlikeli atık yönetimi protokollerine uygun olarak bertaraf edildi.

1. Hayvan ve enstrüman hazırlama

  1. Tüm prosedürleri steril (otoklavlanmış) aletler ve sarf malzemeleri kullanarak gerçekleştirin. Sterilize edilmiş silikon tüpü (iç çap: 1,5 mm, dış çap: 2,5 mm) yaklaşık 1 cm'lik segmentler halinde kesin. Daha sonra kullanmak için tüp duvarının bir tarafı boyunca uzunlamasına bir kesi yapın.
  2. Sıçanları intraperitoneal pentobarbital (40 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Ayak parmağınızı sıkıştırdıktan sonra pedal çekme refleksi gibi refleks tepkilerinin olup olmadığını kontrol ederek yeterli anesteziyi onaylayın. Anestezi sırasında kornea kurumasını önlemek için gözlere veteriner oftalmik merhem sürün.
  3. Sıçanın karnını ksifoid süreçten kasık simfizine kadar epilasyon yapın ve iki taraflı olarak orta hatta uzatın.
  4. Fareyi ısıtılmış bir cerrahi ped üzerinde sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvlarını lastik iplerle sabitleyin.
  5. Steril bir alanı korumak için steril bir fenestre çarşaf örtün. Cildi povidon-iyot çözeltisi ile hazırlayın. Böbreklerin ve üst üreterlerin yeterli şekilde maruz kalmasını sağlamak için karın boyunca, subksifoid bölgesinden göbek deliğinin hemen altına kadar uzanan orta hat cilt kesisi yapın.
  6. Cerrahi makas kullanarak deri altı dokuları ve fasyayı orta hat boyunca kesin. Cildi ve alttaki dokuları titizlikle katman katman inceleyin ve doku forsepsleri kullanarak retroperitoneal boşluğu tamamen ortaya çıkarın.

2. Geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığı için obstrüktif cerrahi

  1. Sol üreterin doğrudan görüntülenmesini kolaylaştırmak için steril bir çubuk kullanarak bağırsağı karın boşluğunun sağ tarafına geri çekin. Kurumayı önlemek için üreteri tuzlu suya batırılmış gazlı bezle örtün.
  2. Mikroskobik forseps kullanarak sol üreteri diseke edin ve mobilize edin, çevre dokulardan yaklaşık 1.5 cm serbest bırakın.
  3. Serbest bırakılan üreterin altına 1 cm uzunluğunda bir silikon tüp (iç çap: 1,5 mm, dış çap: 2,5 mm) yerleştirin. Tüpün içinde tam bir kılıf sağlamak için forseps kullanın.
  4. Üreter tıkanıklığını indüklemek için silikon tüpü ve üreterin orta kısmını 3-0 ipek iplik kullanarak bağlayın. Aşırı ligasyon kuvvetinden kaçının. Güvenli ancak kaymayan ligasyon sağlamak için silikon tüpü üreterin uzunlamasına ekseni boyunca kademeli olarak çekin.
  5. Bağırsağı periton boşluğu içinde dikkatlice yeniden konumlandırın, gerginlik veya tıkanıklık olmadan uygun hizalamayı sağlayın.
  6. Karın kası ve fasyal tabakaları 2-0 emilmeyen bir sütür kullanarak, yeterli gerilme mukavemeti sağlamak için kavisli bir kesme iğnesi ile sürekli bir şekilde dikin. Cildi 4-0 emilemeyen bir sütürle kapatın, iyileşmeyi desteklemek ve yara ayrışması riskini en aza indirmek için anatomik hizalama ve eşit gerginlik sağlayın.
  7. Kesi bölgesini povidon-iyot çözeltisi ile dezenfekte edin. Sıçanların 7 gün boyunca sabit bir sıcaklıkta kontrollü koşullar altında iyileşmesine izin verin.

3. Geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığının rahatlama cerrahisi

  1. Karnın yeniden açılması ve karın boşluğunun tam olarak açığa çıkması için steril bir kurulum sağlayarak gerekli hayvanları ve aletleri hazırlayın.
  2. Silikon tüpün düğümünü bir neşter bıçağı kullanarak dikkatlice inceleyin. Yapışmayı ve enfeksiyon riskini en aza indirmek için tüpü çıkarın ve karın boşluğunu normal tuzlu su ile sulayın.
  3. Bağırsağı yeniden konumlandırın ve karın duvarı kesisini 4-0 emilemeyen dikişler kullanarak katmanlar halinde dikin. Kesi bölgesini povidon-iyot çözeltisi ile sterilize edin. Fareyi ameliyat sonrası 7 günlük bir iyileşme süresi boyunca kontrollü bir sıcaklık ortamına yerleştirin.
  4. Ameliyat sonrası 14. günde, sıçanları uyuşturun (adım 1.2'de belirtilen prosedürü izleyerek) ve böbrekleri enine olarak iki yarıya bölerek böbrek örneklerini toplayın9.
  5. Histopatolojik inceleme için bir yarısını %4 paraformaldehit içinde saklayın ve diğer yarısını sonraki moleküler analiz için -80 ° C'de saklamak üzere sıvı nitrojen içinde hızla dondurun. Biyokimyasal analizler için kan örnekleri toplayın.
  6. CO2 boğulması yoluyla ötenazi gerçekleştirin ve ardından etik yönergeleri izleyerek servikal çıkık yapın.

4. Takip değerlendirmeleri

  1. Genel iyileşmeyi değerlendirmek için RUUO sonrası vücut ağırlığını takip edin. Ağırlık değişikliklerini kontrol ve UUO gruplarıyla karşılaştırın.
  2. Böbrek iyileşmesini değerlendirmek için böbrek ağırlığını ve böbrek hacmini ölçün.
  3. Böbrek fonksiyonlarındaki iyileşmenin bir göstergesi olarak serum kreatinin (Scr) seviyelerini izleyin9.
  4. Üreter açıklığını doğrulamak için renal pelvise metilen mavisi enjekte edin. Tıkanıklık sonrası iyileşmeyi değerlendirmek için üreteral peristaltizmi ve renklenmeyi gözlemleyin.
  5. RUUO 8,10'dan sonra tübüler bütünlüğü ve böbrek yapısını değerlendirmek için H & E boyaması yapın.
  6. Renal interstisyel fibroz regresyonunu değerlendirmek için Masson'un trikrom boyamasını yapın 8,10.
  7. Doku iyileşmesini ölçmek için UUO ve RUUO grupları arasındaki böbrek hasarı skorlarını 3,8 karşılaştırın.

Sonuçlar

UUO'nun ve sonraki salınımının (RUUO) vücut ağırlığı, böbrek ağırlığı, böbrek hacmi ve serum kreatinin (Scr) seviyeleri üzerindeki etkileri Tablo 1'de özetlendiği gibi değerlendirildi. Veriler, grup başına n = 5 olmak üzere ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur.

6 haftada, yerli grup ortalama vücut ağırlığı 234 g ± 16 g, böbrek ağırlığı 0.9107 g ± 0.0475 g ve böbrek hacmi 0.8962 cm³ ± 0.0502 cm...

Tartışmalar

Bu model, üreteri çevrelemek, yapısal destek sağlamak için bir silikon tüp kullanır ve ardından kompresyon yoluyla tam üreter tıkanıklığını indüklemek için ipek bir iplikle ligasyon yapar. Yedi gün sonra, böbrek dekompresyonunu ve idrar yolu bütünlüğünün ve işlevselliğinin restorasyonunu kolaylaştırmak için ligasyon ve silikon tüp çıkarılır.

Silikon elastomerlerden üretilen silikon borular, mükemmel esneklik, biyouyumluluk,...

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu çalışma, Geleceğin Tıbbında Gençlik İnovasyonu Programı, Chongqing Tıp Üniversitesi (W0056), Chongqing Bilim ve Sağlık Ortak TCM Teknoloji İnovasyonu ve Uygulama Geliştirme Projesi (2020ZY023877) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ForcepsShanghai Medical Devices Co.,Ltd20220032
GauzeSichuan Kelun Co., Ltd20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain KitSolarbioG1120
Insulin needlesKDL Medical Devices20193140938
Masson’s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
Medical Cotton ballsSichuan Kelun Co., Ltd20170037
Medical Cotton sticksSichuan Kelun Co., Ltd20172140026
Methylene blueTianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory14038-43-8
Microscopic forcepsSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS50985
Needle holdersSuqian Shifeng Medical Devices Co., LtdS7005
Povidone-iodine SolutionSichuan Kelun Co., Ltd514001
SalineSichuan Kelun Co., Ltd20220004
SD RatsSPF(Beijing)Biotechnology Co.,LtdD025
Silicone tubingTaizhou Chunshi New Materials Co., LtdCS356
Silk suture Qiangsheng Medical Devices Co.,LtdSA84G
Surgical bladeHuanan Yunyue Medical Devices Co.,LtdCE0434
Surgical scissorsShanghai Medical Devices Co.,LtdJ21130
SyringeTongmai medical devices20183140304
Tissue ForcepsJiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., LtdJ36030

Referanslar

  1. Chaves, L. D. et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ t cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836989 (2013).
  2. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  3. Aranda-Rivera, A. K. et al. Sulforaphane protects from kidney damage during the release of unilateral ureteral obstruction (RUUO) by activating nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (nrf2): Role of antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic mechanisms. Free Radic Biol Med. 212, 49-64 (2024).
  4. Narváez Barros, A. et al. Reversal unilateral ureteral obstruction: A mice experimental model. Nephron. 142 (2), 125-134 (2019).
  5. Cochrane, A. L. et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3623-3630 (2005).
  6. Kaeidi, A. et al. The therapeutic approaches of renal recovery after relief of the unilateral ureteral obstruction: A comprehensive review. Iran J Basic Med Sci. 23 (11), 1367-1373 (2020).
  7. Liu, Y. et al. A porcine model of relief of unilateral ureteral obstruction: Study on self-repairing capability over multiple time points. Mol Cell Biochem. 419 (1-2), 115-123 (2016).
  8. Puri, T. S. et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-1032 (2010).
  9. Chevalier, R. L., Kim, A., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T. Recovery following relief of unilateral ureteral obstruction in the neonatal rat. Kidney Int. 55 (3), 793-807 (1999).
  10. Hesketh, E. E. et al. A murine model of irreversible and reversible unilateral ureteric obstruction. J Vis Exp. 94, e52559 (2014).
  11. Klahr, S. Morrissey, J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 283 (5), F861-875 (2002).
  12. Jin, B. et al. Loss of men1 leads to renal fibrosis and decreases HGF-ADAMTS5 pathway activity via an epigenetic mechanism. Clin Transl Med. 12 (8), e982 (2022).
  13. Fischer, N. G., He, J., Aparicio, C. Surface immobilization chemistry of a laminin-derived peptide affects keratinocyte activity. Coatings (Basel). 10 (6), 560 (2020).
  14. Song, J. et al. Losartan accelerates the repair process of renal fibrosis in UUO mouse after the surgical recanalization by upregulating the expression of tregs. Int Urol Nephrol. 51 (11), 2073-2081 (2019).
  15. Song, J. et al. Regulatory t cells accelerate the repair process of renal fibrosis by regulating mononuclear macrophages. Am J Med Sci. 361 (6), 776-785 (2021).
  16. Yao, Y. et al. Interferon-γ improves renal interstitial fibrosis and decreases intrarenal vascular resistance of hydronephrosis in an animal model. Urology. 77 (3), 761.e768-761.e713 (2011).
  17. Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Chang, A. Y., Cachat, F., Lackey, A. Recovery from release of ureteral obstruction in the rat: Relationship to nephrogenesis. Kidney Int. 61 (6), 2033-2043 (2002).
  18. Lucarelli, G. et al. Delayed relief of ureteral obstruction is implicated in the long-term development of renal damage and arterial hypertension in patients with unilateral ureteral injury. J Urol. 189 (3), 960-965 (2013).
  19. Ito, K. et al. Renal damage progresses despite improvement of renal function after relief of unilateral ureteral obstruction in adult rats. Am J Physiol Renal Physiol. 287 (6), F1283-1293 (2004).
  20. Song, J. et al. A modified relief of unilateral ureteral obstruction model. Ren Fail. 41 (1), 497-506 (2019).
  21. Morrissey, J. et al. Bone morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function. J Am Soc Nephrol. 13 (suppl_1), S14-21 (2002).
  22. Ulm, A. H. Miller, F. An operation to produce experimental reversible hydronephrosis in dogs. J Urol. 88, 337-341 (1962).
  23. Park, H. C. et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (2), F357-364 (2010).
  24. Forni, L. G. et al. Renal recovery after acute kidney injury. Intensive Care Med. 43 (6), 855-866 (2017).
  25. Varela, S., Omling, E., Borjesson, A., Salo, M. Resolution of hydronephrosis after pyeloplasty in children. J Pediatr Urol. 17 (1), 102 e101-102 e107 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 218Obstr ktif nefropatirenal fibrozisRUUOrenal rejenerasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır