Un modelo murino inmaduro de obstrucción ureteral unilateral reversible

Resumen

El presente protocolo describe un modelo reproducible paso a paso de la obstrucción ureteral unilateral.

Resumen

La obstrucción ureteral unilateral (UUO) es una causa común de enfermedad renal crónica (ERC), que conduce a la progresión de la fibrosis intersticial renal y, en última instancia, resulta en daño renal irreversible. El alivio de UUO es crucial. En la literatura se han establecido varios modelos animales de obstrucción ureteral unilateral reversible (ORU), que permiten observar los cambios estructurales y el daño funcional, al tiempo que simulan los cambios fisiológicos y fisiopatológicos tras el alivio de la obstrucción ureteral. En este estudio se estableció un modelo de obstrucción reversible en el uréter murino unilateral mediante un tubo de silicona. Se observó daño renal significativo antes del alivio de la obstrucción, y se observó una recuperación parcial después. A diferencia de la UUO, este modelo previene la hidronefrosis progresiva, lo que conduce a distintos resultados patológicos. Este sencillo procedimiento quirúrgico demuestra una alta tasa de éxito y es prometedor como modelo clásico para investigar la nefropatía obstructiva reversible y los posibles tratamientos para la fibrosis intersticial renal. Además, proporciona una plataforma práctica para estudiar los mecanismos de recuperación de la nefropatía obstructiva, la regeneración de células renales y la remodelación de tejidos.

Introducción

La obstrucción uretral contribuye significativamente a la fibrosis intersticial renal y a la enfermedad renal crónica (ERC), lo que puede provocar daños estructurales irreversibles y alteraciones funcionales en el riñón¹. Si bien la obstrucción ureteral unilateral (UUO) se usa ampliamente para estudiar la lesión renal y la ERC, no replica con precisión los mecanismos de recuperación espontánea que ocurren después de la eliminación de una obstrucción. El modelo UUO consiste en ligar el uréter izquierdo con suturas, lo que resulta en obstrucción permanente, dilatación ureteral, hidronefrosis, compresión del parénquima renal y adelgazamiento cortical. El examen histológico suele revelar dilatación tubular, necrosis de células epiteliales tubulares e inflamación intersticial progresiva y fibrosis². Este modelo investiga principalmente la fibrosis intersticial renal y la pérdida irreversible de la función renal debido a la obstrucción persistente.

Sin embargo, muchas enfermedades renales encontradas en la práctica clínica, como la obstrucción causada por cálculos ureterales o tumores, son reversibles. El modelo de obstrucción ureteral unilateral reversible (RUUO) permite la restauración parcial de la estructura renal y la función del tracto urinario, resolviendo en última instancia la hidronefrosis. La recuperación puede evaluarse mediante técnicas de imagen, examen histológico y análisis de biomarcadores para cuantificar la reducción de la lesión renal y la fibrosis³. Este modelo imita de cerca la fase de recuperación de la nefropatía obstructiva en entornos clínicos y es más adecuado que el UUO para estudiar procesos clave como la inflamación, las respuestas inmunitarias, la regeneración celular y la remodelación tisular 4,5,6,7,8.

El modelo RUUO permite a los investigadores analizar la reparación y regeneración renal después del alivio de la lesión, abordando las limitaciones de la UUO en estudios dinámicos. Al comparar diferentes puntos de tiempo antes y después de la obstrucción, los investigadores pueden investigar las vías moleculares involucradas en la lesión y la reparación, incluida la inflamación, la apoptosis, la fibrosis y la regeneración. Este abordaje mejora la comprensión de los mecanismos de recuperación renal e identifica potenciales dianas terapéuticas 2,3,4,5,8,9,10. Si bien la fibrosis renal a menudo se considera irreversible, las observaciones clínicas sugieren que el alivio temprano de la obstrucción durante las etapas iniciales de la fibrosis puede detener o incluso revertir la progresión de la enfermedad. El modelo RUUO proporciona una valiosa plataforma experimental para investigar este fenómeno¹¹.

Además, el modelo RUUO facilita el estudio de la reversión de la fibrosis tras el alivio de la obstrucción, ofreciendo información sobre los mecanismos de recuperación y las posibles terapias antifibróticas ^3,4. En consecuencia, este modelo es muy práctico para la investigación traslacional. El objetivo principal de este modelo experimental es inducir nefropatía obstructiva a través de la canulación ureteral, seguida de un alivio estandarizado en un punto de tiempo predefinido para garantizar la consistencia. Está optimizado para la simplicidad, la reproducibilidad y la seguridad, lo que lo convierte en una herramienta eficaz para la investigación experimental.

Protocolo

Este estudio en animales se adhirió a las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital Infantil de la Universidad Médica de Chongqing. Un total de 27 ratas macho Sprague Dawley (SD) fueron obtenidas comercialmente y alojadas en el Centro de Animales de Laboratorio del Hospital Infantil de la Universidad Médica de Chongqing (SPF, número de licencia: SYXK (Chongqing) 2007-0016). Las ratas se mantuvieron en condiciones de temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y tuvieron acceso ad libitum a alimentos y agua.

El protocolo se llevó a cabo en ratas SD macho de 6 a 8 semanas de edad y es aplicable a ratas de todas las edades con uréteres bilaterales. En este estudio, quince ratas SD macho de 6 semanas de edad fueron asignadas aleatoriamente a tres grupos: el grupo nativo (n = 5), el grupo UUO (n = 5) y el grupo RUUO (n = 5). Además, se incluyeron cinco ratas SD de 8 semanas de edad (n = 5) como grupo de control adicional. Para establecer el modelo RUUO, se utilizaron 12 ratas, con 7 ratas adicionales para tener en cuenta los riesgos potenciales, como la mortalidad intraoperatoria y postoperatoria, los fracasos quirúrgicos, la obstrucción incompleta y la reversión fallida. Esto garantizó un mínimo de 5 ratas por grupo para los análisis posteriores.

Todos los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales y nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El personal quirúrgico se adhirió a los protocolos de equipo de protección personal (EPP), incluidas mascarillas quirúrgicas, guantes y batas. Para cada procedimiento se utilizaron instrumentos quirúrgicos estériles y se esterilizaron en autoclave antes y después de su uso para mantener la esterilidad. Los materiales de desecho, incluidos objetos punzocortantes y muestras biológicas, se eliminaron de conformidad con los protocolos de gestión de residuos peligrosos para mitigar los riesgos de contaminación y garantizar la seguridad.

1. Preparación de animales e instrumentos

1. Llevar a cabo todos los procedimientos utilizando instrumentos y consumibles estériles (esterilizados en autoclave). Corte el tubo de silicona esterilizado (diámetro interior: 1,5 mm, diámetro exterior: 2,5 mm) en segmentos de aproximadamente 1 cm. Haga una incisión longitudinal a lo largo de un lado de la pared del tubo para su uso posterior.
2. Anestesiar a las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (40 mg/kg) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme la anestesia adecuada verificando la ausencia de respuestas reflejas, como el reflejo de retirada del pedal, al pellizcar la punta del pie. Aplique ungüento oftálmico veterinario en los ojos para evitar que la córnea se seque durante la anestesia.
3. Depila el abdomen de la rata desde la apófisis xifoides hasta la sínfisis púbica y se extiende bilateralmente hasta la línea media.
4. Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla quirúrgica caliente y asegure sus extremidades con cuerdas de goma.
5. Cubra una sábana fenestrada estéril para mantener un campo estéril. Prepare la piel con una solución de povidona yodada. Hacer una incisión en la línea media de la piel a lo largo del abdomen, que se extienda desde la región subxifoides hasta justo debajo del ombligo, para proporcionar una exposición adecuada de los riñones y los uréteres superiores.
6. Incidir los tejidos subcutáneos y la fascia a lo largo de la línea media con unas tijeras quirúrgicas. Diseccione la piel y los tejidos subyacentes meticulosamente capa por capa y exponga completamente el espacio retroperitoneal con pinzas de tejido.

2. Cirugía obstructiva de la obstrucción ureteral unilateral reversible

1. Retraiga el intestino hacia el lado derecho de la cavidad abdominal utilizando un hisopo estéril para facilitar la visualización directa del uréter izquierdo. Cubra el uréter con una gasa empapada en solución salina para evitar la desecación.
2. Diseccionar y movilizar el uréter izquierdo con pinzas microscópicas, liberando aproximadamente 1,5 cm de los tejidos circundantes.
3. Coloque un tubo de silicona de 1 cm de largo (diámetro interior: 1,5 mm, diámetro exterior: 2,5 mm) debajo del uréter liberado. Use pinzas para asegurar un encaje completo dentro del tubo.
4. Lime el tubo de silicona y la parte media del uréter con hilo de seda 3-0 para inducir la obstrucción ureteral. Evite la fuerza excesiva de ligadura. Tire gradualmente del tubo de silicona a lo largo del eje longitudinal del uréter para garantizar una ligadura segura pero antideslizante.
5. Vuelva a colocar el intestino dentro de la cavidad peritoneal con cuidado, asegurándose de una alineación adecuada sin tensión ni obstrucción.
6. Suturar el músculo abdominal y las capas fasciales utilizando una sutura no absorbible 2-0 con una aguja de corte curva de forma continua para proporcionar una resistencia a la tracción adecuada. Cierre la piel con una sutura no absorbible 4-0, asegurando la alineación anatómica y la tensión uniforme para promover la cicatrización y minimizar el riesgo de dehiscencia de la herida.
7. Desinfecte el sitio de la incisión con una solución de povidona yodada. Permita que las ratas se recuperen en condiciones controladas a una temperatura constante durante 7 días.

3. Cirugía de alivio de la obstrucción ureteral unilateral reversible

1. Prepare los animales y los instrumentos necesarios, asegurando una configuración estéril para la reapertura abdominal y la exposición completa de la cavidad abdominal.
2. Disecciona el nudo del tubo de silicona con cuidado con una hoja de bisturí. Retire la sonda e irriga la cavidad abdominal con solución salina normal para minimizar la adherencia y el riesgo de infección.
3. Reposicione el intestino y suture la incisión de la pared abdominal en capas utilizando suturas 4-0 no absorbibles. Esterilice el sitio de la incisión con una solución de povidona yodada. Coloque a la rata en un ambiente de temperatura controlada durante un período de recuperación postoperatorio de 7 días.
4. En el día postoperatorio 14, anestesiar a las ratas (siguiendo el procedimiento mencionado en el paso 1.2) y recoger muestras de riñón seccionando transversalmente los riñones en dos mitades⁹.
5. Almacene la mitad en paraformaldehído al 4% para su examen histopatológico y congele rápidamente la otra mitad en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C para su posterior análisis molecular. Recolectar muestras de sangre para análisis bioquímicos.
6. Realizar la eutanasia mediante asfixia por CO₂ seguida de luxación cervical siguiendo las pautas éticas.

4. Evaluaciones de seguimiento

1. Realice un seguimiento del peso corporal después de la RUUO para evaluar la recuperación general. Compare los cambios de peso con los grupos de control y UUO.
2. Medir el peso y el volumen del riñón para evaluar la recuperación renal.
3. Monitorizar los niveles séricos de creatinina (Scr) como indicador de mejora de la función renal⁹.
4. Inyecte azul de metileno en la pelvis renal para confirmar la permeabilidad ureteral. Observar el peristaltismo ureteral y la coloración para evaluar la recuperación posterior a la obstrucción.
5. Realizar tinción de H&E para evaluar la integridad tubular y la estructura renal después de RUUO ^8,10.
6. Realizar la tinción tricrómica de Masson para evaluar la regresión de la fibrosis intersticial renal ^8,10.
7. Comparar las puntuaciones de daño renal ^3,8 entre los grupos UUO y RUUO para cuantificar la recuperación del tejido.

Resultados

Se evaluaron los efectos de la UUO y su posterior liberación (RUUO) sobre el peso corporal, el peso renal, el volumen renal y los niveles de creatinina sérica (Scr), como se resume en la Tabla 1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE), con n = 5 por grupo.

A las 6 semanas, el grupo nativo presentó un peso corporal promedio de 234 g ± 16 g, un peso renal de 0,9107 g ± 0,0475 g y un volumen renal de 0,8962 cm³ ± 0...

Discusión

Este modelo emplea un tubo de silicona para rodear el uréter, proporcionando soporte estructural, seguido de una ligadura con un hilo de seda para inducir una obstrucción ureteral completa mediante compresión. Después de siete días, se retiran la ligadura y el tubo de silicona para facilitar la descompresión renal y la restauración de la integridad y funcionalidad del tracto urinario.

Los tubos de silicona, fabricados con elastómeros de silicona, ofrec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030