Ein unreifes Mausmodell einer reversiblen einseitigen Harnleiterobstruktion

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein schrittweises, reproduzierbares Modell der einseitigen Harnleiterobstruktion.

Zusammenfassung

Die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) ist eine häufige Ursache für chronische Nierenerkrankungen (CKD), die zum Fortschreiten der interstitiellen Nierenfibrose und schließlich zu irreversiblen Nierenschäden führt. Die Linderung von UUO ist von entscheidender Bedeutung. In der Literatur wurden mehrere Tiermodelle der reversiblen einseitigen Harnleiterobstruktion (RUUO) etabliert, die die Beobachtung von strukturellen Veränderungen und funktionellen Schäden ermöglichen und gleichzeitig physiologische und pathophysiologische Veränderungen nach der Linderung der Harnleiterobstruktion simulieren. In dieser Studie wurde ein reversibles Obstruktionsmodell im unilateralen murinen Harnleiter mit Hilfe eines Silikonschlauchs etabliert. Vor der Linderung der Obstruktion wurde eine signifikante Nierenschädigung beobachtet, danach wurde eine teilweise Genesung festgestellt. Im Gegensatz zu UUO verhindert dieses Modell eine fortschreitende Hydronephrose, was zu unterschiedlichen pathologischen Ergebnissen führt. Dieses einfache chirurgische Verfahren weist eine hohe Erfolgsquote auf und ist vielversprechend als klassisches Modell für die Untersuchung der reversiblen obstruktiven Nephropathie und mögliche Behandlungen der interstitiellen Nierenfibrose. Darüber hinaus bietet es eine praktische Plattform für die Untersuchung der Mechanismen der Genesung von obstruktiver Nephropathie, der Regeneration von Nierenzellen und des Gewebeumbaus.

Einleitung

Eine Harnröhrenobstruktion trägt erheblich zur interstitiellen Nierenfibrose und chronischen Nierenerkrankung (CKD) bei, was möglicherweise zu irreversiblen strukturellen Schäden und Funktionsbeeinträchtigungen in der Niere führt¹. Während die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) häufig zur Untersuchung von Nierenschäden und CKD eingesetzt wird, repliziert sie nicht genau die spontanen Erholungsmechanismen, die nach der Entfernung einer Obstruktion auftreten. Beim UUO-Modell wird der linke Harnleiter mit Nähten ligiert, was zu einer dauerhaften Obstruktion, Harnleitererweiterung, Hydronephrose, Kompression des Nierenparenchyms und kortikaler Ausdünnung führt. Die histologische Untersuchung zeigt typischerweise eine tubuläre Dilatation, eine tubuläre Epithelzellnekrose sowie eine progressive interstitielle Entzündung und Fibrose². Dieses Modell untersucht hauptsächlich die interstitielle Fibrose der Nieren und den irreversiblen Verlust der Nierenfunktion aufgrund einer persistierenden Obstruktion.

Viele Nierenerkrankungen, die in der klinischen Praxis auftreten, wie z. B. Obstruktionen durch Harnleitersteine oder Tumore, sind jedoch reversibel. Das Modell der reversiblen unilateralen Harnleiterobstruktion (RUUO) ermöglicht die teilweise Wiederherstellung der Nierenstruktur und der Harnwegsfunktion, wodurch letztendlich die Hydronephrose behoben wird. Die Genesung kann durch bildgebende Verfahren, histologische Untersuchungen und Biomarkeranalysen beurteilt werden, um die Verringerung von Nierenschäden und Fibrose zu quantifizieren³. Dieses Modell ahmt die Erholungsphase der obstruktiven Nephropathie im klinischen Umfeld genau nach und eignet sich besser als UUO für die Untersuchung von Schlüsselprozessen wie Entzündungen, Immunreaktionen, Zellregeneration und Gewebeumbau 4,5,6,7,8.

Das RUUO-Modell ermöglicht es Forschern, die Nierenreparatur und -regeneration nach der Linderung von Verletzungen zu analysieren und dabei die Einschränkungen von UUO in dynamischen Studien zu berücksichtigen. Durch den Vergleich verschiedener Zeitpunkte vor und nach der Obstruktion können Forscher molekulare Signalwege untersuchen, die an Verletzungen und Reparaturen beteiligt sind, einschließlich Entzündungen, Apoptose, Fibrose und Regeneration. Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der Mechanismen der renalen Erholung und identifiziert potenzielle therapeutische Ziele 2,3,4,5,8,9,10. Während Nierenfibrose oft als irreversibel angesehen wird, deuten klinische Beobachtungen darauf hin, dass eine frühzeitige Linderung der Obstruktion in den Anfangsstadien der Fibrose das Fortschreiten der Krankheit stoppen oder sogar umkehren kann. Das RUUO-Modell bietet eine wertvolle experimentelle Plattform, um dieses Phänomen zu untersuchen¹¹.

Darüber hinaus erleichtert das RUUO-Modell die Untersuchung der Fibroseumkehr nach Obstruktionslinderung und bietet Einblicke in die Erholungsmechanismen und mögliche antifibrotische Therapien ^3,4. Daher ist dieses Modell für die translationale Forschung sehr praktisch. Das primäre Ziel dieses experimentellen Modells ist die Induktion einer obstruktiven Nephropathie durch Harnleiterkanülierung, gefolgt von einer standardisierten Entlastung zu einem vordefinierten Zeitpunkt, um die Konsistenz zu gewährleisten. Es ist auf Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Sicherheit optimiert, was es zu einem effektiven Werkzeug für die experimentelle Forschung macht.

Protokoll

Diese Tierstudie entsprach den Richtlinien der Deklaration von Helsinki und wurde von der Forschungsethikkommission des Kinderkrankenhauses der Medizinischen Universität Chongqing genehmigt. Insgesamt wurden 27 männliche Sprague Dawley (SD) Ratten kommerziell beschafft und im Laboratory Animal Center des Kinderkrankenhauses der Chongqing Medical University (SPF, Lizenznummer: SYXK (Chongqing) 2007-0016) untergebracht. Die Ratten wurden unter kontrollierten Temperaturbedingungen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser.

Das Protokoll wurde an männlichen SD-Ratten im Alter von 6-8 Wochen durchgeführt und ist auf Ratten jeden Alters mit bilateralen Harnleitern anwendbar. In dieser Studie wurden fünfzehn 6 Wochen alte männliche SD-Ratten nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: die native Gruppe (n = 5), die UUO-Gruppe (n = 5) und die RUUO-Gruppe (n = 5). Zusätzlich wurden fünf 8 Wochen alte SD-Ratten (n = 5) als zusätzliche Kontrollgruppe eingeschlossen. Zur Etablierung des RUUO-Modells wurden 12 Ratten verwendet, wobei 7 zusätzliche Ratten beschafft wurden, um potenzielle Risiken wie intraoperative und postoperative Mortalität, chirurgische Misserfolge, unvollständige Obstruktion und erfolglose Umkehrung zu berücksichtigen. Dies stellte sicher, dass mindestens 5 Ratten pro Gruppe für nachfolgende Analysen verwendet wurden.

Alle chirurgischen Eingriffe wurden in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das chirurgische Personal hielt sich an die Protokolle für persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich chirurgischer Masken, Handschuhe und Kittel. Für jeden Eingriff wurden sterile chirurgische Instrumente verwendet, die vor und nach dem Gebrauch autoklaviert wurden, um die Sterilität zu erhalten. Abfallmaterialien, einschließlich scharfer Gegenstände und biologischer Proben, wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen zur Entsorgung gefährlicher Abfälle entsorgt, um Kontaminationsrisiken zu minimieren und die Sicherheit zu gewährleisten.

1. Vorbereitung von Tieren und Instrumenten

1. Führen Sie alle Eingriffe mit sterilen (autoklavierten) Instrumenten und Verbrauchsmaterialien durch. Schneiden Sie den sterilisierten Silikonschlauch (Innendurchmesser: 1,5 mm, Außendurchmesser: 2,5 mm) in ca. 1 cm lange Segmente. Machen Sie einen Längsschnitt entlang einer Seite der Rohrwand für die spätere Verwendung.
2. Narkose der Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (40 mg/kg) (nach institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob beim Einklemmen der Zehen keine Reflexreaktionen, wie z. B. der Pedalrückzugsreflex, auftreten. Tragen Sie veterinärmedizinische Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern.
3. Enthaaren Sie den Hinterleib der Ratte vom Processus xiphoideus bis zur Symphyse pubica und erstrecken Sie sich bilateral bis zur Mittellinie.
4. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer beheizten Operationsunterlage und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Gummiseilen.
5. Drapieren Sie ein steriles Fensterblatt, um ein steriles Feld zu erhalten. Bereiten Sie die Haut mit Povidon-Jod-Lösung vor. Machen Sie einen Hautschnitt in der Mittellinie entlang des Bauches, der sich von der subxiphoiden Region bis knapp unter den Nabel erstreckt, um eine ausreichende Freilegung der Nieren und oberen Harnleiter zu gewährleisten.
6. Schneiden Sie das Unterhautgewebe und die Faszien entlang der Mittellinie mit einer chirurgischen Schere ein. Präparieren Sie die Haut und das darunterliegende Gewebe sorgfältig Schicht für Schicht und legen Sie den retroperitonealen Raum mit einer Gewebezange vollständig frei.

2. Obstruktive Operation bei reversibler einseitiger Harnleiterobstruktion

1. Ziehen Sie den Darm mit einem sterilen Tupfer auf die rechte Seite der Bauchhöhle zurück, um die direkte Visualisierung des linken Harnleiters zu erleichtern. Decken Sie den Harnleiter mit mit Kochsalzlösung getränkter Gaze ab, um ein Austrocknen zu verhindern.
2. Präparieren und mobilisieren Sie den linken Harnleiter mit einer mikroskopisch kleinen Pinzette, wobei Sie ca. 1,5 cm vom umgebenden Gewebe befreien.
3. Legen Sie einen 1 cm langen Silikonschlauch (Innendurchmesser: 1,5 mm, Außendurchmesser: 2,5 mm) unter den befreiten Harnleiter. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine vollständige Umhüllung des Rohrs zu gewährleisten.
4. Lilizieren Sie den Silikonschlauch und den mittleren Teil des Harnleiters mit 3-0 Seidenfaden, um eine Harnleiterobstruktion zu induzieren. Vermeiden Sie übermäßige Ligaturkraft. Ziehen Sie den Silikonschlauch allmählich entlang der Längsachse des Harnleiters, um eine sichere, aber rutschfeste Ligatur zu gewährleisten.
5. Positionieren Sie den Darm vorsichtig in der Bauchhöhle neu und sorgen Sie für eine korrekte Ausrichtung ohne Spannungen oder Verstopfungen.
6. Vernähen Sie die Bauchmuskeln und Faszienschichten mit einer nicht resorbierbaren 2-0-Naht mit einer gebogenen Schneidenadel in kontinuierlicher Weise, um eine ausreichende Zugfestigkeit zu gewährleisten. Verschließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren 4-0-Naht, die eine anatomische Ausrichtung und eine gleichmäßige Spannung gewährleistet, um die Heilung zu fördern und das Risiko einer Wunddehiszenz zu minimieren.
7. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung. Lassen Sie die Ratten sich 7 Tage lang unter kontrollierten Bedingungen bei konstanter Temperatur erholen.

3. Entlastungsoperation bei reversibler einseitiger Harnleiterobstruktion

1. Bereiten Sie die notwendigen Tiere und Instrumente vor und stellen Sie sicher, dass die Wiedereröffnung des Bauches und die vollständige Freilegung der Bauchhöhle steril sind.
2. Präparieren Sie den Knoten des Silikonschlauchs vorsichtig mit einer Skalpellklinge. Entfernen Sie den Schlauch und spülen Sie die Bauchhöhle mit normaler Kochsalzlösung, um Adhäsion und Infektionsrisiko zu minimieren.
3. Positionieren Sie den Darm neu und vernähen Sie den Bauchwandschnitt in Schichten mit 4-0 nicht resorbierbaren Nähten. Sterilisieren Sie die Inzisionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung. Bringen Sie die Ratte für eine 7-tägige postoperative Erholungsphase in eine Umgebung mit kontrollierter Temperatur.
4. Am postoperativen Tag 14 die Ratten anästhesieren (gemäß dem in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren) und Nierenproben entnehmen, indem die Nieren quer in zwei Hälften geschnitten^{werden 9}.
5. Lagern Sie eine Hälfte in 4%igem Paraformaldehyd für die histopathologische Untersuchung und frieren Sie die andere Hälfte schnell in flüssigem Stickstoff ein, um sie für die anschließende molekulare Analyse bei -80 °C zu lagern. Sammeln Sie Blutproben für biochemische Analysen.
6. Führen Sie Euthanasie durch CO₂ -Erstickung mit anschließender Gebärmutterhalsluxation gemäß ethischen Richtlinien durch.

4. Nachfolgende Bewertungen

1. Verfolgen Sie das Körpergewicht nach der RUUO, um die Gesamterholung zu beurteilen. Vergleichen Sie Gewichtsänderungen mit den Kontroll- und UUO-Gruppen.
2. Messen Sie das Nierengewicht und das Nierenvolumen, um die Nierenerholung zu bewerten.
3. Überwachen Sie den Serumkreatininspiegel (Scr) als Indikator für eine Verbesserung der Nierenfunktion⁹.
4. Injizieren Sie Methylenblau in das Nierenbecken, um die Durchgängigkeit des Harnleiters zu bestätigen. Beobachten Sie die Peristaltik und Färbung des Harnleiters, um die Genesung nach der Obstruktion zu beurteilen.
5. Durchführung einer H&E-Färbung zur Beurteilung der tubulären Integrität und der Nierenstruktur nach RUUO ^8,10.
6. Führen Sie die Masson-Trichrom-Färbung durch, um die Regression der interstitiellen Nierenfibrose^zu beurteilen ^8,10.
7. Vergleichen Sie die Nierenschadenswerte ^3,8 zwischen der UUO- und der RUUO-Gruppe, um die Gewebewiederherstellung zu quantifizieren.

Ergebnisse

Die Auswirkungen von UUO und seiner anschließenden Freisetzung (RUUO) auf das Körpergewicht, das Nierengewicht, das Nierenvolumen und die Serumkreatininspiegel (Scr) wurden bewertet, wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt, wobei n = 5 pro Gruppe ist.

Nach 6 Wochen wies die native Gruppe ein mittleres Körpergewicht von 234 g ± 16 g, ein Nierengewicht von 0,9107 g ± 0,0475 g ...

Diskussion

Bei diesem Modell wird ein Silikonschlauch verwendet, um den Harnleiter zu umschließen und strukturelle Unterstützung zu bieten, gefolgt von einer Ligatur mit einem Seidenfaden, um eine vollständige Harnleiterobstruktion durch Kompression zu induzieren. Nach sieben Tagen werden die Ligatur und der Silikonschlauch entfernt, um die Dekompression der Niere und die Wiederherstellung der Integrität und Funktionalität der Harnwege zu erleichtern.

Silikonschläu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	20220032
Gauze	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140152
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Solarbio	G1120
Insulin needles	KDL Medical Devices	20193140938
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Medical Cotton balls	Sichuan Kelun Co., Ltd	20170037
Medical Cotton sticks	Sichuan Kelun Co., Ltd	20172140026
Methylene blue	Tianjin Dengfeng Chemical Reagent Factory	14038-43-8
Microscopic forceps	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S50985
Needle holders	Suqian Shifeng Medical Devices Co., Ltd	S7005
Povidone-iodine Solution	Sichuan Kelun Co., Ltd	514001
Saline	Sichuan Kelun Co., Ltd	20220004
SD Rats	SPF(Beijing)Biotechnology Co.,Ltd	D025
Silicone tubing	Taizhou Chunshi New Materials Co., Ltd	CS356
Silk suture	Qiangsheng Medical Devices Co.,Ltd	SA84G
Surgical blade	Huanan Yunyue Medical Devices Co.,Ltd	CE0434
Surgical scissors	Shanghai Medical Devices Co.,Ltd	J21130
Syringe	Tongmai medical devices	20183140304
Tissue Forceps	Jiangxi Yuyuan Medical Equipment Co., Ltd	J36030