模拟性别肯定激素疗法的大鼠模型的建立

摘要

该方案描述了两种啮齿动物模型的开发，通过皮下注射睾酮或雌二醇加醋酸环丙孕酮（用于跨性别者的人类治疗）来模拟性别肯定激素疗法：剂量的设定、相关生物标志物的识别和效果的评估。

摘要

跨性别者 （TG） 是指性别认同和出生时分配的性别不匹配的个体。他们经常接受性别肯定激素疗法 （GAHT），这是一种医学干预，可以获得更符合他们个人性别认同的第二性征，从而在改善众多社会心理变量方面提供一致的结果。然而，GAHT 针对不同的身体系统，并且记录了一些副作用，尽管尚未完全识别和表征。因此，接受 GAHT 的 TG 人群可能被视为易感人群亚群，在风险评估的框架中应特别注意，例如，通过使用目标动物模型。本研究描述了实施两种模拟 GAHT 的大鼠模型的程序：模拟 TG 女性 GAHT 的去男性化-女性化模型 （dMF） 和模拟 TG 男性 GAHT 的去男性化-男性化模型 （dFM）。这些模型是通过施用用于人 GAHT 的相同激素来实现的，即用于 dMF 的 β-雌二醇加醋酸环丙孕酮和用于 dFM 的睾酮，通过相同的暴露途径进行 2 周。在治疗期间每天检查大鼠，以评估健康状况和潜在的攻击性行为。在处死时，对血液和靶组织进行取样和储存，用于生化、分子和组织病理学分析。还评估了性别特异性参数，即精子数量和尺寸。此外，在雄性和雌性大鼠肝脏中独家和/或优先表达的 CYP450 亚型被鉴定并表征为新的生物标志物，以验证 GAHT 的成功并设置模型。甲状腺受累也被探索为内分泌系统的关键靶点。

引言

个人对男性、女性、两者都不是、两者兼而有之或介于¹ 之间的心理感知称为性别认同。它可以匹配生理性别（顺性别），也可以不同（跨性别 - TG）。TG 男性是指出生为女性但认为自己是男性的个体。TG 女性出生时是男性，但认为自己是女性²。据估计，目前全球有 2500 万 TG 人³，他们中的大多数人患有性别焦虑症，这是一种以性别与出生时被分配的性别不一致为特征的心理状况⁴，这可能导致社会歧视以及工作和家庭中的困难，往往导致抑郁， 焦虑和压力⁵.由于这些原因，TG 患者经常接受性别肯定激素治疗 （GAHT） 和/或性别确认手术。TG 男性的 GAHT 特征是睾酮 （T） 的给药（表 1），TG 女性的 GAHT 特征是雌激素 （E2） 加抗雄激素（表 2）⁶。

GAHT 通常持续个体的整个生命周期，持续作用于内分泌系统 ^7,8。因此，分析 GAHT 对 TG 患者健康的影响及其潜在的长期影响非常重要。此外，TG 患者与普通人群一样，会接触到化学污染物——尤其是内分泌干扰物 （ED）——这些污染物以 GAHT 的形式针对内分泌系统，导致过度刺激⁹。

ED 是一组通过改变不同的激素和代谢过程（例如天然激素的分泌、激活、合成、释放和结合）来影响生物体和/或其后代的化学物质。由于 ED 在环境中广泛存在，因此食品和日常使用的产品（例如塑料瓶和容器、金属食品罐的衬里、清洁剂、阻燃剂、食品、玩具、化妆品和杀虫剂等）普通人群在一生中都会持续暴露¹⁰。此外，即使是低剂量接触 ED 也会导致组织和器官损伤，与 ED 暴露相关的一个常见现象是在实验室动物和人类中发生性别特异性效应¹¹。例如，接触食品接触材料双酚 A （BPA） 与女性子宫内膜异位症和多囊卵巢综合征等健康风险有关，并且由于其雌激素作用，生育能力下降¹²。在男性中，BPA 会降低水平并降低精子质量¹³。此外，杀虫剂与女性患乳腺癌的风险较高和男性患严重生育问题有关¹³。到目前为止，还没有特定的工具可用于研究环境污染物（包括 ED）对 TG 人群的毒理学影响⁹。

本研究旨在描述为开发两种 TG 动物模型选择的方法和参数：去男性化-女性化模型 （dMF） 和去男性化模型 （dFM）。特别是，根据当前的人类疗法选择合适的剂量水平、时间和激素给药方式¹⁴.此外，唯一定义模型的组织和功能生物标志物被识别和表征。此外，详细描述了动物治疗的疗效和耐受性以及选择最合适的用于长期研究的标志物以及用于此类目的的技术。

为了表征模型，分析了以下终点：睾酮 （T） 血清水平（评估 GAHT 在两种模型中成功的最佳生物标志物 ^9,15）;雌二醇 （E2） 血清水平（两种型号）;促甲状腺激素 （TSH） 和甲状腺素 （T4） （dMF 模型）;精子计数（dMF 模型）;尺寸（dFM 模型）;生殖器官、肝脏和甲状腺的组织病理学分析（两种模型）。此外，还分析了以下性别特异性肝细胞色素 P450 亚型（CYP450，两种模型）的基因表达^16,17：CYP2C11（在雄性肝脏中特异性表达）、CYP3A18（在雄性肝脏中表达量是女性的 25 倍）、CYP2C12（在女性肝脏中特异性表达）和 CYP2C6（主要在女性肝脏中表达，但以较低水平存在， 也在雄性中）。

研究方案

这些研究是根据指令 2010/63/EU、2014 年 3 月 4 日第 26 号意大利法令和经合组织良好实验室规范 （GLP） 原则进行的。该研究方案已获得意大利卫生部的批准（授权号 806/2021-PR）。在这里，购买 16 只性成熟的年轻男女 Sprague-Dawley 大鼠（304 ± 13 克雄性大鼠和 190 ± 7 克雌性大鼠，8-9 周龄）并在标准实验室条件（22 ± 0.5 °C，50%-60% 相对湿度，12 小时暗光交替，每小时 12-14 次换气）下饲养在两个/笼 中，随意提供水和食物。在所有笼子中，为了丰富每只动物的环境，插入啃木块并每周更换一次。

注意：选择 8-9 周龄的动物是因为 GAHT 可以在青春期开始（Tanner 阶段 2 至 3），相当于啮齿动物的 8-9 周，并且持续时间很长，可能持续 TG 人的整个生命周期⁹。

1. 群体大小和动物护理

1. 使用年轻的成年雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠（8-9 周龄）作为模型，因为大鼠是经合组织指示的首选物种（例如，指南 421 生殖/发育毒性筛选测试），也是经合组织指南 407 中提出和考虑的唯一啮齿动物物种（在啮齿动物中重复剂量的 28 天口服毒性研究，更新了 EI 检测参数）。
2. 使用 G*Power 软件进行组大小调整。对于 dFM 和 dMF 模型，选择四个测试组：一个对照组 （C） 和三组用不同剂量的 GAHT 治疗的动物。参考两组（治疗剂量与 C）与 Mann-Whitney 检验的比较进行尺寸调整，双尾显着性水平 alpha = 0.0167（对应于 alpha = 0.05，Bonferroni 校正应用于每个治疗剂量与 C 之间的 3 次比较），1-β 功效 = 0.80。
   1. 计算的大鼠/组数如下：
      对于 dFM 模型，动物/组 n=4，根据 Kinnear 等人 ¹⁸ 指示治疗 2 周后，以下水平：对照组：0.2 ± 0.3 ng/mL，激素治疗组：16 ± 5 ng/mL（平均值±标准差），对应于用 Cohen 的 d = 4.46 测量的效应维度（非常大的效应）。
      对于 dMF 模型：动物/组 n=3，根据 Gómez 等人 ¹⁹ 表示，治疗 2 周后，以下水平：对照组：1.901 ± 0.413 ng/mL，激素治疗组：0.043 ± 0.023 ng/mL（平均值±标准误差），对应于用 Cohen 的 d = 6.35 测量的效应维度（非常大的效应）。
   2. 为了对齐两个模型，选择每性别/组 n=4 只动物，总共 N = 32 只动物。
3. 适应 1 周后，按性别将大鼠分为两个实验组 （dMF 和 dFM，4 只大鼠/组），每个实验组由一个 C （对照雄性 CM 和对照雌性 CF） 和所选 GAHT 的三个治疗组组成。
4. 每天监测所有大鼠 2 次（上午 8：30 和下午 4：00），以检查一般健康状况和由于 GAHT 给药引起的潜在攻击性。使用具有最适合实验动物体重的动态加权功能的分析天平，每周记录体重 （bw） 和饲料消耗量 2 次。
5. 在 dFM 实验模型中，使用数字仪表进行精确读数，在治疗开始前（第 0 点）和治疗结束时（第 13 点）测量所有大鼠的直径。
6. 在处死前称量所有动物，在 dMF 模型中，处死后立即去除附睾以进行精子计数。

2. 剂量选择和准备

1. 使用以下三种剂量的激素给予 dFM 大鼠：每周 5、10.5 和 22.5 mg/kg，对于 dMF 模型，使用以下三个选定的剂量水平 （DL）：DL1 E2 0.045 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg，DL2 E2 0.09 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg 和 DL3 E2 0.18 mg/kg + CPA 0.2 mg/kg。
   注意：选择所有剂量时，都考虑到了用于 TG 人群¹⁵ 的主要人类临床指南和文献中可用的有限数据。
2. 每周使用化学安全罩准备所有储备溶液。将所有物质适当混合到芝麻油中作为载体，确保它们完全溶解。
   注：对于这两种型号，使用剂量转换计算器 （https://dosecal.cftri.res.in/） 输入要转换的剂量、已设置剂量的物种、动物物种以及要转换剂量的重量。对于 dFM 模型（表 3），人类激素治疗，每周最大剂量为 100 mg T²⁰。大鼠计算的剂量为每周 10.5 mg/kg T。大鼠¹⁸ 的第二剂为每周 22.5 mg/kg。第三剂为每周 5 mg/kg，通过在两个计算剂量之间维持 2.1 的因子来确定。对于 dMF 模型，见表 4，剂量基于推荐的人类方案²¹ 和通过体内研究获得的数据 14,19,22。

3. 动物治疗

1. 通过捏住和提起注射部位的皮肤，形成一种帘子，进行 T（对于 dFM 模型）和 E2 加 CPA（对于 dMF 模型）的皮下给药。然后，将 1 mL 注射器的针头平行于动物的背部插入。进入后，缓慢注入所需体积（T 为 100 μL;E2+CPA 为 200 μL）²³。
   1. 按以下方式对待动物：对于 dFM 模型，每周 2 次施用溶于芝麻油（载体）中的庚酸 T 庚酸酯，持续 2 周（每次皮下注射 T 100 μL）。对于 dMF 模型，每周 5 次施用溶解在芝麻油（载体）中的 E2 加醋酸 CPA，持续 2 周（每次皮下注射 200 μL）。仅用载体（芝麻油）以相同的方式处理 C 组大鼠。

4. 采血、处死和组织取样

1. 治疗 2 周后，就在牺牲之前，使用气体麻醉系统并麻醉所有动物。通过剂量从 2% 到 3.5% 异氟醚在 100% 氧气中以 1.5 L/min 的速率诱导麻醉，直到在透明的聚苯乙烯诱导室中反射丧失。将大鼠置于加热垫上的俯卧位，并在整个心内血液采样过程中通过标准大鼠鼻罩以 1.5% 至 3.5% 的维持剂量调节异氟醚的剂量。
2. 准备一个带有 5G 针头的 21 mL 注射器，消除真空。用手指探查心脏，小心地将针头插入垂直于身体的外侧胸壁，大约在弯曲的肘部点，肋骨 5 和 6 之间。一旦进入心室，血液就会通过毛细血管进入注射器。缓慢连续地缩回注射器活塞，直到抽出血液。
3. 采血后，将大鼠放入 CO₂ 室中，以便使用 CO₂ 窒息进行安乐死，填充率为每分钟 30%-70% 的腔室体积置换。2-3 分钟后，通过监测呼吸和心跳²⁴ 来验证动物的死亡。
4. 祭祀后，将每只动物仰卧放在解剖台上，前腿朝上，后腿朝下，并用别针固定。在动物的腹部撒上消毒剂溶液。
5. 切除以下器官：睾丸、附睾、子宫、卵巢、肝脏和甲状腺。称量并储存在装有 35 mL 10% 缓冲福尔马林（所有器官）或 Bouin 溶液（仅睾丸）的 50 mL 试管中，或将它们收集在低温管（器官/试管）中并立即在液氮中冷冻（用于在 -80 °C 下储存）。
   1. 首先，用剪刀在中线上从耻骨到上腹部剪开皮肤。在肋骨上做两个横向切口，并在切口两侧反射皮肤，露出胸腔脏器。
   2. 先切除生殖器官;在雄性大鼠中，去除睾丸，睾丸是位于腹腔内的椭圆形配对器官，处于腹腔内位置（阴囊囊）。切开并按压阴囊以确保睾丸伸出，然后轻轻抓住它们。用钳子夹住内脏脂肪，然后将睾丸从内脏上切开。切除后，称量睾丸并将其储存在 Bouin 溶液中用于组织病理学分析。
   3. 在雌性大鼠中，首先小心翼翼地抓住子宫，然后从内脏脂肪组织中切下卵巢（位于两个子宫角的末端）。切除后，称量卵巢。
   4. 在雌性和雄性大鼠中，移动到肝脏所在的腹腔右侧。肝脏是一个多分叶器官，可以识别许多部分：左内侧（小）、左侧（大）、右内侧（较小）、右侧（大）、尾状核和方叶²⁵。用镊子抓住肝脏，注意不要弄破它。用钳子抓住剑突，用剪刀完全剪断隔膜。
   5. 使用镊子提起剑突并从腹腔中提取肝脏。用剪刀将肝脏与隔膜分开。之后，称量肝脏并储存。
   6. 对于甲状腺提取，在剪刀的帮助下，沿着动物的脖子垂直切割，去除皮肤和肌肉组织，然后轻轻修剪甲状腺所在的气管末端。储存甲状腺以供进一步分析²⁶.
6. 如下所述进行精子计数。
   1. 切除睾丸后，抓住附睾，附睾附着在相应睾丸的后缘并包含在阴囊中。
   2. 在这个实验中，精液样本是从右附睾的尾部采集的。收集时，用剪刀清洁脂肪和结缔组织的尾部，将其与剩余部分分开，并将其放入含有 1 mL DMEM 的培养皿 （35 mm x 10 mm） 中。用剪刀剪开，用巴斯德移液管流动，以促进内容物的释放。
   3. 将获得的所有液体转移到 15 mL 试管中，并用 DMEM 使体积达到 10 mL（稀释因子 1：10=0.1）。移液内容物以均质化并制备悬浮液。轻轻摇晃后，取 10 μL 悬浮液加载 Neubauer 腔室。加载相机，加载相机 3 分钟后，开始计数。

5. 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 测定

1. 在 2 mL 试管中收集血液样品（每只动物约 2-5 mL），并让它们在室温下凝固 1 小时。将所有血液样品在离心机中以 4 °C 和 3000 x g 离心 2 次 15 分钟。
2. 离心血液具有多层外观，具有三层不同颜色。顶层由血浆（通常为黄色或透明）组成，即血液的液体部分;等离子体下方的层可能呈白色或灰色，是 Buffy 外套。最低层含有红细胞，颜色可能呈深红色或亮红色。为了测定性激素水平，用移液管收集所有样品的血清（不要接触血沉棕黄层或红细胞层），将它们分成等分试样 （500 μL） 并储存在 -80 °C。
3. 在这两种模型中，进行 ELISA 检测以检测和/或测量样品中蛋白质、抗体或抗原的存在，以测定性激素。使用直接方法并按照每个 ELISA 试剂盒的说明进行作。在这项研究中，测定大鼠血清中以下激素的水平：E2、大鼠雌二醇 ELISA;T， 小鼠/大鼠睾酮 Elisa;TSH、大鼠 ELISA 试剂盒和 T4、大鼠 ELISA 试剂盒。

6. 组织病理学分析

1. 根据以下程序准备组织的组织学载玻片。
2. 提取时将子宫、卵巢、甲状腺和肝脏的样品固定在 10% 缓冲福尔马林中至少 48 小时。
   注意：在化学罩下工作。不要吸入该物质/混合物。避免产生蒸气/气溶胶。
3. 在流水下洗涤样品 1 小时，然后储存在 80% 乙醇 （C₂H₅OH） 中直至处理，以保护原生质结构免受细胞死亡导致的改变。
4. 将睾丸固定在由 15 mL 苦味酸饱和溶液、5 mL 浓福尔马林 （33%-40%） 和 1 mL 冰醋酸组成的 Bouin 溶液中 48 小时。用 80% 乙醇洗涤样品。
   注意：在化学罩下工作。
5. 使用自动组织处理器在固体石蜡中进行包埋。在包涵体过程结束时，将样品放入倒入熔化石蜡的小金属容器中，并在冷冻板上冷却，形成切割块。根据所需的切割部分确定它们的方向。
6. 之后，使用旋转切片机切割样品。使用小刷子收集 5-6 μm 切片，将它们铺在 37 °C 的水中几秒钟，然后将它们放在显微镜载玻片上。让载玻片垂直沥干几分钟，然后在 36 °C 的烘箱中干燥至少 1 小时。
7. 如下所述进行苏木精和伊红染色。
   1. 通过将载玻片浸入萜烯来源的透明剂（二甲苯替代品）中 5 分钟来脱蜡。
   2. 通过将载玻片浸入以下系列的分级乙醇中来使载玻片再水化。对于每种溶液，每次浸泡 2 分钟：100% 乙醇、95% 乙醇、80% 乙醇、50% 乙醇和蒸馏水。
      注意：这可以是方案的终止点，载玻片可以在 RT 中在水中放置数小时。或者，载玻片也可以储存在 4 °C 的水中。
   3. 将载玻片放入 Mayer 苏木精中 5 分钟。立即将它们放回装有自来水的容器中 5 分钟。将自来水倒入容器最远离各部分的后角。定期清空容器，直到水中的紫色不再存在。
      注意：为防止切片从载玻片上剥落，请勿将水直接流到载玻片上。
   4. 将玻片放入 1% 伊红 Y 水溶液中 2 分钟。将载玻片转移到蒸馏水中 15 秒。通过将载玻片浸入以下系列的分级乙醇中使载玻片脱水。对于每种溶液，每次浸渍 15 秒：50% 乙醇、80% 乙醇、95% 乙醇。
   5. 将玻片置于 100% 乙醇中 1 分钟，然后将其更换为新鲜的 100% 乙醇 1 分钟。将玻片放入萜烯来源的清除剂（二甲苯替代品）中 2 分钟，然后将其更换为萜烯来源的新鲜清除剂（二甲苯替代品）再 2 分钟。一次取出一张载玻片并放置盖玻片。
   6. 用安装介质覆盖切片，并将盖玻片放在载玻片底部。
      注意： 确保封固介质将载玻片拉入到位。如果盖玻片不平整，请轻轻敲击到位。用纸巾吸干多余的封固剂。
   7. 将清洁抹布浸入萜烯来源的清除剂（二甲苯替代品）中，然后擦拭载玻片的背面以去除任何滴落的介质。将载玻片平放在移动的固体表面上，如一块纸板。如步骤 6.7.6 中所述，将盖玻片添加到所有剩余的载玻片中。让载玻片干燥，让封固剂在通风橱中在 RT 下硬化。
      注意：在化学罩下工作。
8. 染色后，用盖玻片盖住样品，并使用光学显微镜对其进行评估。组织病理学变化已根据分布、严重程度和形态学特征进行了描述。
9. 使用 5 分评估量表（0 到 4）进行伤害评分，根据 Shackelford 等人解释的标准考虑变化的严重程度²⁷ ，总结如下：
   0 级：无变化
   1 级：最小变化。这种效果在组织上几乎看不见;小且不频繁。影响小于或等于 10% 的组织部分。
   2 级：光线变化。代表一个小的组织学变化。当组织或其结构的体积变化在 11% 到 20% 之间时，使用此等级。
   3 级：中度变化。这种变化在组织中很明显。度数表示存在 21%-40% 的组织或其结构之间的变化
   4 级：明显变化。组织或其结构的压倒性组织学变化。变异影响 41%-100% 的组织。
10. 对子宫、卵巢、睾丸和甲状腺进行定量组织形态学分析。使用应用于光学显微镜的图像分析系统检查组织切片，并按照下面描述的步骤进行作。
    1. 子宫：使用 2 倍物镜测量右子宫角、子宫外肌层和内肌层以及子宫腔每个横切面的总面积。计算子宫内膜和子宫肌层的面积以及子宫内膜和子宫肌层面积之间的比率²⁸。
    2. 卵巢：使用卵巢中央位置的整个切片之一来揭示处于不同发育阶段的卵泡;使用 4 倍物镜计数初级、次级、黄体、Graaf 和闭锁卵泡。根据 Fortune²⁹ 对卵泡进行分类。此外，测量每个样品的卵巢面积及其卵泡密度（卵泡数/卵巢面积 x 100）³⁰。
    3. 睾丸：使用 10 倍物镜，测量 20 小管/样品;此外，测量总管腔面积、总面积、纵径和横径²⁸。
    4. 甲状腺：测量以下参数：卵泡密度（卵泡数量与给定面积之间的比率，10 倍物镜）;间接滤泡细胞高度 （随机选择的五个滤泡/样本中滤泡面积和胶体面积的平均比率 40x 目标）;滤泡上皮面积和细胞核数的平均比率（在同一滤泡中以确定滤泡成熟）;滤泡细胞高度（随机选择的 5 个滤泡/样品中 5 个细胞高度的平均值，64x 物镜）³¹。

7. 基因表达

1. 对于这两种模型，使用储存在 -80 °C 的肝脏样品进行基因表达分析。 遵循使用试剂盒纯化总 RNA 的方案，从动物组织的裂解物开始。
   1. 要获得肝脏裂解物，请用微型稀释剂研磨组织样品 （10 mg），向组织样品中加入 600 μL RL BUFFER（试剂盒提供），然后继续研磨直至样品均质化。
2. 提取后立即使用荧光光谱仪定量获得的 RNA 并评估其质量（变性或任何蛋白质残基的存在）。在 260 nm 和 280 nm 的波长处进行分光光度吸光度读数，核酸和蛋白质分别吸收。
3. 评估总 RNA 浓度后，按照制造商的说明使用 cDNA 合成试剂盒，将每个样品中含有 1 μg 总 RNA 的适当体积逆转录到 cDNA 中。
4. 通过 RT-PCR 分析获得的 cDNA。
   1. 为了分析目标基因的基因表达，已经为每个靶基因以及组成型表达的内参基因磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 设计了特异性正向和反向引物。使用 Web 应用程序 Primer-BLAST （www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast） 选择最佳引物，这些引物将保证仅对目标基因配对的特异性，并获得由商业供应商合成的寡核苷酸。所用引物对的序列见表 5。
   2. 用终浓度为 100 mM 的不含 RNAse 的蒸馏水重悬冻干引物。使用专用试剂盒进行 qPCR 分析。以 20 μL 的最终体积进行反应，以 1：40 稀释退火的 cDNA。将每个样品一式两份加载到 96 孔 PCR 板中。
   3. 按照以下程序在热循环仪上进行 qPCR 运行：在 95 °C 下 1 个循环，持续 10 分钟;在 95°C 下循环 40 次，持续 15 秒，在 58 °C 下持续 30 秒，在 72 °C 下循环 1 分钟。最后，执行 55°C 至 95°C （30 s/°C） 的解离循环，以验证扩增产物的特异性。使用机器的专用软件，获取每个样品的阈值循环值（Cycle Threshold， Ct）。根据 Pfaffl 公式³²，将结果表示为 ΔΔ Ct（delta delta Ct）：
      ΔCt 靶基因 = Ct 对照 - Ct 处理
      ΔCt 内参基因 = Ct 对照 - Ct 处理
      ΔCt = ΔCt 靶基因 - ΔCt 内参基因

8. 数据分析

1. 使用电子表格执行数据管理。使用统计分析软件执行分析。使用特定软件设计图形。
2. 将体重增加、饲料消耗、绝对和相对器官重量、激素血清水平、组织形态测量数据和基因表达数据表示为平均值±标准差。执行非参数 Kruskal-Wallis 分析，然后进行事后成对比较（Mann-Whitney 检验）。
3. 使用 2 因子 Fisher 精确检验分析组织学数据，以确定与对照组的显著差异，包括被分配到某个类别的样本，而没有任何严重程度分级（总发现发生率）的参考。使用 Cochran-Armitage 趋势检验来确定剂量反应趋势。如果 p 值< 0.05，则认为组间差异显著。

结果

正如 Tassinari 等人 ¹⁴ 和 Tammaro 等人 ³³ 所证明的那样，以下结果表明 GAHT 在大鼠身上的成功以及模型的适当性。

没有记录到死亡或异常行为，例如攻击性，也没有观察到毒性或痛苦的临床体征（例如，活动减少、竖毛和未梳理的外观）¹⁴。

成年雄性和雌性大鼠在发情期和发情?...

讨论

模拟 GAHT 的啮齿动物模型的实施对于研究 TG 患者的潜在特异性易感性和脆弱性以及治疗的长期结果至关重要，通常持续他们的一生。

鉴于文献中类似研究的数量稀缺，该实验的关键点是选择剂量来设置模型;这样的剂量应该足够低，以便与动物的长期给药相容，而不会引起不良反应、毒性和/或死亡。另一个关键点是采用的最佳给药途径，同时考虑到?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical balance ABJ 320-4NM	Kern	Z741091
Bouin	Biooptica	05-M01008
Centrifuge 5415 R	Eppendorf		For eppendorf
Cyproterone Acetate	Sigma-Aldrich	C3412
D-MEM medium	Gibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXN	Smobio	TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for Windows	GraphPad Software
Hematoxylin	Biooptica	05-06002/L
Heosin	Biooptica	05-10007/L
Imaging Software	Nikon		NIS-BR
JMP 10 statistical software	SAS Institute
Microm	Thermo Scientific	HM 325
Microscopy	Nikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISA	Biovendor	RTC001R	96T
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		ND-1000
Paraffina	Biooptica	087910
Portable Balances SCOUT STX2202	OHAUS	30253064
Primers	Life Technologies		Designed by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISA	Biovendor	RTC009R	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
SensiFASTcDNA Synthesis Kit	Bioline	BIO-65053	50 reaction
Sesam Oil	ACROS	AC241000010
Sprague Dawley rats male and female	Envigo		8/9 weeks old
Standard diets	Mucedola	4RF18
T4(Thyroxine) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK8716	96T
Testosterone enanthate	Sigma-Aldrich	T3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus Bioer	Aurogene
Tissue processor	Shandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KIT	Norgen	17200	50 column
Victor 3 Multilabel reader	Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerate	Sigma-Aldrich	E1631