Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, testosteron veya estradiol artı siproteron asetatın (transseksüel insanlar için insan terapilerinde kullanılır) deri altı uygulaması yoluyla cinsiyeti onaylayan hormon tedavilerini taklit eden iki kemirgen modelinin geliştirilmesini açıklar: dozların belirlenmesi, ilgili biyobelirteçlerin tanımlanması ve etkilerin değerlendirilmesi.

Özet

Transseksüel (TG) bireyler, cinsiyet kimliği ile doğumda atanan cinsiyeti uyuşmayan bireylerdir. Genellikle, bireysel cinsiyet kimlikleriyle daha uyumlu ikincil cinsiyet özelliklerinin edinilmesine izin veren ve çok sayıda sosyo-psikolojik değişkenin iyileştirilmesinde tutarlı sonuçlar sağlayan tıbbi bir müdahale olan cinsiyeti onaylayan hormon tedavisine (GAHT) tabi tutulurlar. Bununla birlikte, GAHT farklı vücut sistemlerini hedefler ve henüz tam olarak tanımlanmamış ve karakterize edilmemiş olsa da bazı yan etkiler kaydedilmiştir. Bu nedenle, GAHT uygulanan TG bireyleri, popülasyonun duyarlı bir alt grubu olarak kabul edilebilir ve risk değerlendirmesi çerçevesinde, örneğin hedeflenen hayvan modellerinin kullanılması yoluyla özel dikkat gösterilmelidir. Bu çalışma, GAHT'yi taklit eden iki sıçan modelini uygulamak için belirlenen prosedürleri açıklamaktadır: TG kadınları için GAHT'yi taklit eden demaskülize-dişileştirici model (dMF) ve TG erkekleri için GAHT'yi taklit eden defeminizan-erkekleştirici model (dFM). Modeller, insan GAHT için kullanılan aynı hormonların, yani dMF için β-estradiol artı siproteron asetat ve dFM için testosteronun, 2 haftalık bir süre boyunca aynı maruz kalma yollarıyla uygulanması yoluyla uygulanmıştır. Sıçanlar, sağlık durumunu ve potansiyel olarak agresif davranışları değerlendirmek için tedavi sırasında günlük olarak kontrol edilir. Kurban çekiminde kan ve hedef dokulardan numune alındı ve biyokimyasal, moleküler ve histopatolojik analizler için saklandı. Cinsiyete özgü parametreler, yani sperm sayısı ve klitoral boyutlar da değerlendirilmiştir. Ek olarak, erkek ve dişi sıçan karaciğerinde münhasıran ve/veya tercihen eksprese edilen CYP450 izoformları, GAHT'nin başarısını doğrulamak ve modeli belirlemek için yeni biyobelirteçler olarak tanımlanır ve karakterize edilir. Tiroid tutulumu da endokrin sistemde önemli bir hedef olarak araştırılmıştır.

Giriş

Bireyin psikolojik olarak erkek, kadın, hiçbiri, her ikisi ya daikisinin arasında bir yerde 1 olduğunu algılamasına cinsiyet kimliği denir. Biyolojik cinsiyetle (cisgender) eşleşebilir veya farklı olabilir (transgender - TG). TG erkeği, kadın olarak doğan ancak kendini erkek olarak tanımlayan bir bireydir. Bir TG kadını erkek olarak doğar ancak kendini kadın olarak tanımlar2. Şu anda, dünya çapında 25 milyon TG insanı olduğu tahmin edilmektedir3, bunların çoğu, cinsiyetleri ile doğumda atandıkları cinsiyet arasındaki uyumsuzluk ile karakterize psikolojik bir durum olan cinsiyet disforisinden muzdariptir 4, bu da sosyal ayrımcılığa ve işte ve ailede zorluklara yol açabilirve genellikle depresyona yol açabilir, Kaygı ve Stres5. Bu nedenlerden dolayı, TG insanları genellikle cinsiyeti onaylayan hormon tedavisi (GAHT) ve / veya cinsiyeti onaylayan cerrahiden geçerler. TG erkekleri için GAHT, testosteron (T) (Tablo 1) ve TG kadınları için östrojen (E2) artı antiandrojenlerin (Tablo 2) uygulanması ile karakterizedir.6.

GAHT genellikle bireyin tüm yaşamı boyunca sürer ve endokrin sistem üzerinde sürekli olarak etki eder 7,8. Bu nedenle, GAHT'ın TG halkının sağlığı üzerindeki etkisini ve potansiyel uzun süreli etkilerini analiz etmek önemlidir. Ayrıca, TG insanları, genel popülasyon olarak, endokrin sistemi GAHT olarak hedef alan ve aşırı uyarılmaya neden olan kimyasal kirleticilere - özellikle endokrin bozuculara (ED) - maruz kalmaktadır9.

ED, doğal hormonların salgılanması, aktivasyonu, sentezi, salınması ve bağlanması gibi farklı hormonal ve metabolik süreçleri değiştirerek organizmaları ve/veya soylarını etkileyen bir grup kimyasaldır. ED, çevrede, gıda ve günlük kullanım ürünlerinde (örneğin, plastik şişeler ve kaplar, metal gıda kutularının astarları, deterjanlar, alev geciktiriciler, gıda, oyuncaklar, kozmetikler ve böcek ilaçları vb.) yaygın olduğundan, genel nüfus tüm yaşam boyunca sürekli olarak maruz kalmaktadır10. Ek olarak, ED'lere düşük dozda maruz kalma bile doku ve organ hasarına yol açabilir ve ED maruziyeti ile ilişkili yaygın bir fenomen, hem laboratuvar hayvanlarında hem de insanlarda cinsiyete özgü etkilerin ortaya çıkmasıdır11. Örnek olarak, gıda ile temas eden malzeme olan bisfenol A'ya (BPA) maruz kalmak, östrojenik etkileri nedeniyle kadınlarda endometriozis ve polikistik over sendromu gibi sağlık risklerinin yanı sıra doğurganlığın azalmasıyla bağlantılıdır12. Erkeklerde, BPA seviyeleri düşürebilir ve sperm kalitesini azaltabilir13. Ek olarak, pestisitler kadınlarda daha yüksek meme kanseri riski ve erkeklerde önemli doğurganlık sorunları ile ilişkilidir13. Şimdiye kadar, TG insanlarında ED de dahil olmak üzere çevresel kirleticilerin toksikolojik etkilerini incelemek için özel bir araç mevcut değildir9.

Bu çalışma, iki TG hayvan modelinin geliştirilmesi için seçilen yöntemleri ve parametreleri tanımlamayı amaçlamaktadır: bir erkeksizleştirici-dişileştirici model (dMF) ve bir kadınsızlaştırıcı-erkekleştirici model (dFM). Özellikle, mevcut insan tedavilerine dayanarak hormonların uygun doz seviyelerinin seçimi, zamanı ve uygulanma şekli değerlendirilir14. Ayrıca, modelleri benzersiz bir şekilde tanımlayan doku ve fonksiyonel biyobelirteçler tanımlanır ve karakterize edilir. Ek olarak, hayvanlarda tedavinin etkinliği ve tolere edilebilirliği ile uzun süreli çalışmalarda kullanılmak üzere en uygun belirteçlerin seçimi, bu tür amaçlar için kullanılan tekniklerle birlikte ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Modelleri karakterize etmek için aşağıdaki uç noktalar analiz edilir: testosteron (T) serum seviyesi (her iki modelde de GAHT'nin başarısını değerlendirmek için en iyi biyobelirteç 9,15); estradiol (E2) serum seviyesi (her iki model); tiroid uyarıcı hormon (TSH) ve tiroksin (T4) (dMF modeli); sperm sayısı (dMF modeli); klitoral boyut (dFM modeli); Üreme organları, karaciğer ve tiroidin histopatolojik analizi (her iki model için). Ek olarak, aşağıdaki cinsiyete özgü karaciğer sitokrom P450 izoformlarının (her iki model için CYP450'ler) gen ekspresyonu da analiz edilir 16,17: CYP2C11 (özellikle erkek karaciğerinde eksprese edilir), CYP3A18 (erkek karaciğerinde kadınlara göre 25 kat daha fazla eksprese edilir), CYP2C12 (özellikle kadın karaciğerinde eksprese edilir) ve CYP2C6 (ağırlıklı olarak kadın karaciğerinde eksprese edilir, ancak daha düşük seviyelerde bulunur, ayrıca erkeklerde).

Protokol

Çalışmalar, 2010/63/EU sayılı Direktif, 4 Mart 2014 tarihli 26 sayılı İtalyan Kanun Hükmünde Kararnamesi ve OECD İyi Laboratuvar Uygulamaları İlkeleri (GLP) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (yetki no. 806/2021-PR). Burada, her iki cinsiyetten 16 genç cinsel olgun Sprague-Dawley sıçanı (304 ± 13 g erkek sıçan ve 190 ± 7 g dişi sıçan, 8-9 haftalık) satın alınır ve standart laboratuvar koşullarında (22 ± 0.5 °C, %50-%60 bağıl nem, saatte 12-14 hava değişimi ile 12 saat karanlık-ışık değişimi) su ve yiyecek ad libitum ile iki/kafes halinde barındırılır. Tüm kafeslerde, her hayvanın çevresel zenginleştirilmesi için, odun kemirme blokları yerleştirin ve bunları haftalık olarak değiştirin.

NOT: 8-9 haftalık hayvanlar, GAHT'ın ergenlik döneminde başlayabileceğinden (Tanner evreleri 2 ila 3), kemirgenlerde 8-9 haftaya karşılık geldiğinden ve potansiyel olarak TG halkının tüm yaşamı boyunca uzun süre devam ettiğindenseçilmiştir 9.

1. Grup boyutlandırma ve hayvan bakımı

  1. Sıçan OECD tarafından belirtilen tercih edilen tür olduğundan (örneğin, Kılavuz 421 Üreme / Gelişimsel Toksisite Tarama Testi) ve OECD Yönergesi 407'de önerilen ve dikkate alınan tek kemirgen türü olduğundan (EI'lerin tespiti için parametrelerle güncellenmiş) genç yetişkin erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanlarını (8-9 haftalık) model olarak kullanın.
  2. Grup boyutlandırma için G*Power yazılımını kullanın. Hem dFM hem de dMF modelleri için dört test grubu seçin: bir kontrol grubu (C) ve farklı dozlarda GHT ile tedavi edilen üç hayvan grubu. Mann-Whitney testi ile iki grup arasındaki karşılaştırmaya (tedavi dozuna karşı C), iki kuyruklu anlamlılık seviyesi alfa = 0.0167 (her tedavi dozu ile 3 karşılaştırmaya uygulanan Bonferroni düzeltmesi ile alfa = 0.05'e karşılık gelir) ve 1-beta gücü = 0.80.
    1. Hesaplanan sıçan/grup sayısı aşağıdaki gibidir:
      dFM modeli için, hayvanlar/grup n=4, Kinnear ve ark.18'e göre 2 haftalık tedaviden sonra aşağıdaki seviyeleri gösterir: kontrol grubunda: 0.2 ± 0.3 ng/mL, hormon tedavisi grubunda: 16 ± 5 ng/mL (ortalama ± standart sapma), Cohen'in d = 4.46 (çok büyük etki) ile ölçülen bir etki boyutuna karşılık gelir.
      dMF modeli için: hayvanlar/grup n=3, Gómez ve ark.19'a göre 2 haftalık tedaviden sonra aşağıdaki seviyeleri gösterir: kontrol grubu: 1.901 ± 0.413 ng/mL ve hormon tedavisi grubu: 0.043 ± 0.023 ng/mL (standart hata ±) Cohen'in d = 6.35 (çok büyük etki) ile ölçülen bir etki boyutuna karşılık gelir.
    2. İki modeli hizalamak için, toplam N = 32 hayvan olmak üzere cinsiyet/grup başına n=4 hayvan seçin.
  3. 1 haftalık iklimlendirmeden sonra, sıçanları cinsiyete göre iki deney grubuna (dMF ve dFM, 4 sıçan / grup) ayırın, her biri bir C (kontrol erkek, CM ve kontrol dişi, CF) ve seçilen GAHT'ın üç tedavi grubundan oluşur.
  4. Genel sağlık koşullarını ve GAHT uygulamasına bağlı potansiyel saldırganlığı kontrol etmek için tüm sıçanları günde 2 kez (8:30 ve 16:00'da) izleyin. Laboratuvar hayvanlarının ağırlığı için en uygun dinamik ağırlıklandırma işlevine sahip bir analitik terazi kullanarak haftada 2 kez canlı ağırlığı (cana yakın) ve yem tüketimini kaydedin.
  5. dFM deneysel modelinde, tedavinin başlamasından hemen önce (nokta 0) ve tedavinin sonunda (nokta 13) tüm sıçanların klitoral çapını, hassas okumalar için dijital bir gösterge kullanarak ölçün.
  6. Kurban edilmeden önce tüm hayvanları tartın ve dMF modelinde kurban edildikten hemen sonra sperm sayımını gerçekleştirmek için epididimi çıkarın.

2. Doz seçimi ve hazırlanması

  1. dFM sıçanlarına uygulanacak aşağıdaki üç hormon dozunu kullanın: dMF modeli için haftada 5, 10.5 ve 22.5 mg / kg, aşağıdaki üç seçilmiş doz seviyesini (DL) kullanın: DL1 E2 0.045 mg / kg + CPA 0.2 mg / kg, DL2 E2 0.09 mg / kg + CPA 0.2 mg / kg ve DL3 E2 0.18 mg / kg + CPA 0.2 mg / kg.
    NOT: Tüm dozlar, TG kişileri15 için kullanılan ana insan klinik kılavuzları ve literatürde bulunan sınırlı veriler dikkate alınarak seçilmiştir.
  2. Tüm stok çözeltilerini bir kimyasal güvenlik başlığı kullanarak haftalık olarak hazırlayın. Tüm maddeleri susam yağına bir araç olarak uygun şekilde karıştırın ve tamamen çözünmelerini sağlayın.
    NOT: Her iki model için, dönüştürülecek dozu, dozun ayarlandığı türü, hayvan türünü ve dozun dönüştürüleceği ağırlığı girmek için bir doz dönüştürme hesaplayıcısı (https://dosecal.cftri.res.in/) kullanın. dFM modeli için (Tablo 3), insan hormon tedavisi, haftada maksimum 100 mg T dozu20. Sıçanlarda hesaplanan doz haftada 10.5 mg / kg T'dir. İkinci doz,sıçanlarda 18 haftada 22.5 mg / kg'dır. Üçüncü doz haftada 5 mg / kg'dır ve hesaplanan iki doz arasında 2.1 faktörünün korunmasıyla tanımlanır. DMF modeli için Tablo 4'e bakınız, dozajlar insanlar için önerilen rejimlere21 ve in vivo çalışmalardan elde edilen verileredayanmaktadır 14,19,22.

3. Hayvan tedavisi

  1. Enjeksiyon bölgesinde cildi sıkıştırıp kaldırarak ve bir tür perde oluşturarak T (dFM modeli için) ve E2 artı CPA'nın (dMF modeli için) deri altı uygulamasını gerçekleştirin. Ardından, 1 mL'lik bir şırınganın iğnesini hayvanın sırtına paralel olarak yerleştirin. İçeri girdikten sonra gerekli hacmi yavaşça enjekte edin (T için 100 μL; E2 + CPA için 200 μL)23.
    1. Hayvanlara şu şekilde davranın: dFM modeli için, 2 hafta boyunca haftada 2 kez susam yağında (araç) çözülmüş T enantat uygulayın (her deri altı T enjeksiyonu için 100 μL). DMF modeli için, 2 hafta boyunca haftada 5 kez susam yağında (araç) çözülmüş E2 artı CPA asetat uygulayın (her deri altı enjeksiyon için 200 μL). C grubu farelere sadece araçta aynı şekilde davranın (susam yağı).

4. Kan örneklemesi, kurban verme ve doku örneklemesi

  1. 2 haftalık tedaviden sonra, kurban kesiminden hemen önce, gazlı bir anestezi sistemi kullanın ve tüm hayvanları uyuşturun. Berrak, polistiren indüksiyon odasında reflekslerin kaybına kadar 1.5 L / dk oranında% 100 oksijende% 2 ila% 3.5 izofluran arasında değişen dozda anesteziyi indükleyin. Sıçanı ısıtma yastığı üzerinde yüzüstü pozisyona getirin ve intrakardiyak kan örnekleme prosedürü boyunca standart bir sıçan burun maskesi tarafından uygulanan% 1.5 ila% 3.5 arasında değişen bir idame dozunda izofluran dozunu düzenleyin.
  2. Vakumu ortadan kaldırarak 21G iğneli 5 mL'lik bir şırınga hazırlayın. Kalbi parmaklarla inceleyerek, iğneyi vücuda dik olan lateral torasik duvara, yaklaşık olarak bükülmüş dirseklerin noktasında, kaburgalar 5 ve 6 arasında dikkatlice sokun. Kalp ventrikülünün içine girdikten sonra, kan kılcal damar yoluyla şırıngaya girer. Kan çekene kadar şırınga pistonunu yavaşça ve sürekli olarak geri çekin.
  3. Kan örneklemesinden sonra, dakikada oda hacminin% 30 -% 70'inin yer değiştirmesi ile CO2 boğulması kullanarak ötenazi yapmak için sıçanları CO2 odasına yerleştirin. 2-3 dakika sonra, solunumu ve kalp atışını izleyerek hayvanların ölümünü doğrulayın24.
  4. Kurban kesiminden sonra, her hayvanı ön bacakları yukarı ve arka bacakları aşağı bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda diseksiyon masasına yerleştirin ve pimlerle sabitleyin. Hayvanın karnına dezenfektan bir solüsyon serpin.
  5. Aşağıdaki organları çıkarın: testisler, epididim, uterus, yumurtalıklar, karaciğer ve tiroid. Bunları 35 mL% 10 tamponlu formalin (tüm organlar) veya Bouin çözeltisi (sadece testis) ile 50 mL'lik tüplerde tartın ve saklayın veya kriyojenik tüplerde (bir organ / tüp) toplayın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurun (-80 ° C'de saklamak için).
    1. İlk olarak, cildi orta hatta, pubisten üst karın bölgesine kadar makasla kesin. Göğüs kafesinde iki yanal kesi yapın ve torasik iç organları ortaya çıkarmak için kesiğin her iki tarafındaki cildi yansıtın.
    2. Önce üreme organlarını çıkarın; Erkek sıçanlarda, karın içi pozisyonda (skrotal kese) karın boşluğunda bulunan oval şekilli çift organlar olan testisleri çıkarın. Testislerin dışarı çıktığından emin olmak için skrotal keseyi kesin ve bastırın, ardından nazikçe kavrayın. Viseral yağı pense ile tutun, ardından testisleri iç organlardan kesin. Eksizyondan sonra, testisleri tartın ve histopatolojik analiz için Bouin solüsyonunda saklayın.
    3. Dişi sıçanlarda, önce uterusu hassas bir şekilde tutun, daha sonra yumurtalıkları (her iki uterus boynuzunun ucunda bulunur) viseral yağ dokusundan kesin. Eksizyondan sonra yumurtalıkları tartın.
    4. Hem dişi hem de erkek sıçanlarda, karaciğerin bulunduğu karın boşluğunun sağ tarafına geçin. Karaciğer çok loblu bir organdır ve birçok parçayı tanımlamak mümkündür: sol medial (daha küçük), sol lateral (majör), sağ medial (daha küçük), sağ lateral (majör), kaudat ve kare lob25. Karaciğeri forseps ile tutun, kırmamaya dikkat edin. Ksifoid işlemini pense ile kavrayın ve diyaframı makasla tamamen kesin.
    5. Ksifoid sürecini kaldırmak ve karaciğeri karın boşluğundan çıkarmak için forseps kullanın. Karaciğeri diyaframdan makasla ayırın. Bundan sonra, karaciğeri tartın ve saklayın.
    6. Tiroid ekstraksiyonu için, makas yardımıyla, hayvanın boynu boyunca dik olarak kesin, cildi ve kas sistemini çıkarın ve tiroid bezinin bulunduğu trakeanın uçlarını nazikçe kesin. Daha fazla analiz için tiroidi saklayın26.
  6. Sperm sayımını aşağıda anlatıldığı gibi yapın.
    1. Testis çıkarıldıktan sonra, ilgili testisin arka kenarına tutturulmuş ve skrotumda bulunan epididimis tutulmalıdır.
    2. Bu deneyde, sağ epididimin kuyruğundan semen örnekleri alınır. Toplama sırasında, yağ ve bağ dokusunun kuyruğunu makas kullanarak temizleyin, kalan kısımdan ayırın ve 1 mL DMEM içeren bir Petri kabına (35 mm x 10 mm) yerleştirin. İçeriğin serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için makasla kesin ve bir Pasteur pipeti ile akıtın.
    3. Elde edilen tüm sıvıyı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve DMEM ile hacmi 10 mL'ye getirin (seyreltme faktörü 1: 10 = 0.1). Homojen hale getirmek ve bir süspansiyon oluşturmak için içeriği pipetleyin. Hafif bir sallamadan sonra, Neubauer haznesini doldurmak için süspansiyondan 10 μL alın. Kamerayı yükleyin ve 3 dakika kamera yüklendikten sonra saymaya başlayın.

5. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) testi

  1. Kan örneklerini (hayvan başına yaklaşık 2-5 mL) 2 mL'lik tüplerde toplayın ve oda sıcaklığında 1 saat pıhtılaşmalarına izin verin. Tüm kan örneklerini 2 ° C'de ve 4 x g'da 15 dakika boyunca 3000x bir santrifüjde döndürün.
  2. Santrifüj edilen kan, üç farklı renk katmanı ile çok katmanlı bir görünüme sahiptir. Üst tabaka, kanın sıvı kısmı olan plazmadan (genellikle sarı veya şeffaf) oluşur; plazmanın altındaki katman beyazımsı veya gri bir renge sahip olabilir ve Buffy kaplamasıdır. En alt tabaka kırmızı kan hücreleri içerir ve renk koyu kırmızı veya parlak kırmızı görünebilir. Cinsiyet hormonu seviyelerini belirlemek için, tüm örneklerin serumunu bir pipetle toplayın (buffy coat veya eritrosit tabakalarına dokunmadan), bunları alikotlara (500 μL) bölün ve -80 ° C'de saklayın.
  3. Her iki modelde de, cinsiyet hormonlarının belirlenmesi için numunedeki proteinlerin, antikorların veya antijenlerin varlığını tespit etmek ve/veya ölçmek için ELISA testi yapın. Doğrudan yöntemi kullanın ve her bir ELISA kitinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada, sıçanlarda aşağıdaki hormonların serum seviyeleri belirlenmiştir: E2, Sıçan Estradiol ELISA; T, Fare / Sıçan Testosteron Elisa; TSH, Sıçan ELISA Kiti ve T4, Sıçan ELISA Kiti.

6. Histopatolojik analiz

  1. Aşağıdaki prosedürlere göre dokuların histolojik slaytlarını hazırlayın.
  2. Ekstraksiyon sırasında uterus, yumurtalık, tiroid ve karaciğer örneklerini en az 48 saat boyunca% 10 tamponlu formalin içinde sabitleyin.
    DİKKAT: Kimyasal bir başlık altında çalışın. Maddeyi/karışımı solumayın. Buhar/aerosol üretmekten kaçının.
  3. Numuneleri 1 saat akan su altında yıkayın ve ardından protoplazmik yapıyı hücresel ölümden kaynaklanan değişikliklerden korumak içinişlenene kadar %80 etil alkolde (C2H5OH) saklayın.
  4. Testisi, 48 saat boyunca 15 mL doymuş pikrik asit çözeltisi, 5 mL konsantre formalin (% 33 -% 40) ve 1 mL buzlu asetik asitten oluşan Bouin çözeltisine sabitleyin. Numuneleri %80 etil alkol ile yıkayın.
    DİKKAT: Kimyasal bir başlık altında çalışın.
  5. Otomatik bir doku işlemcisi kullanarak katı parafine dahil etme işlemi gerçekleştirin. Dahil etme işleminin sonunda, numuneleri erimiş parafinin döküldüğü küçük metal kaplara yerleştirin ve donmuş bir plaka üzerinde soğutun, kesim için blokları oluşturun. İstenilen kesme bölümüne bağlı olarak onları yönlendirin.
  6. Bundan sonra, dönen bir mikrotom kullanarak numuneleri kesin. Küçük fırçalar kullanarak 5-6 μm'lik kesitler toplayın, birkaç saniye boyunca 37 °C'de suya yayın ve mikroskop cam slaytları üzerine yerleştirin. Slaytları birkaç dakika dik olarak süzülmeye bırakın ve 36 °C fırında en az 1 saat kurutun.
  7. Aşağıda tarif edildiği gibi hematoksilen ve eozin boyama işlemini gerçekleştirin.
    1. Slaytları 5 dakika boyunca terpen kökenli temizleme maddesine (ksilen ikamesi) batırarak deparafinize edin.
    2. Slaytları, aşağıdaki kademeli etanol serisine daldırarak yeniden sulandırın. Her çözelti için, daldırma başına 2 dakika: %100 etanol, %95 etanol, %80 etanol, %50 etanol ve damıtılmış su.
      NOT: Protokol için bir durma noktası olabilir ve slaytlar RT'de birkaç saat suda bırakılabilir. İsteğe bağlı olarak kaydıraklar 4 °C'de suda da saklanabilir.
    3. Slaytları 5 dakika boyunca Mayer'in hematoksilinine yerleştirin. Hemen 5 dakika musluk suyu ile kabın içine geri aktarın. Bölümlerden en uzaktaki kabın arka köşesine musluk suyu akıtın. Sudaki mor renk artık mevcut olmayana kadar kabı periyodik olarak boşaltın.
      NOT: Kaydıraklardan bölümlerin soyulmasını önlemek için, kaydırakların üzerine doğrudan su akıtmayın.
    4. Slaytları 2 dakika boyunca eozin Y% 1 sulu çözeltiye yerleştirin. Slaytları 15 saniye boyunca damıtılmış suya aktarın. Slaytları, aşağıdaki kademeli etanol serisine daldırarak kurutun. Her çözelti için, daldırma başına 15 s: %50 etanol, %80 etanol, %95 etanol.
    5. Slaytları 1 dakika boyunca %100 etanol içine yerleştirin ve 1 dakika daha taze %100 etanol ile değiştirin. Slaytları 2 dakika boyunca terpen kökenli bir temizleme maddesine (ksilen ikamesi) yerleştirin ve 2 dakika daha terpen kökenli taze bir temizleme maddesine (ksilen ikamesi) değiştirin. Her seferinde bir slaytı çıkarın ve bir lamel yerleştirin.
    6. Bölümleri montaj ortamı ile örtün ve sürgünün altına bir lamel yerleştirin.
      NOT: Montaj ortamının sürgüyü yerine çektiğinden emin olun. Lamel düz değilse, yavaşça yerine vurun. Fazla montaj ortamını bir kağıt havlu kullanarak kurulayın.
    7. Terpen kökenli temizleme maddesine (ksilen ikamesi) bir temizleme mendili batırın ve damlayan ortamı çıkarmak için sürgünün arkasını silin. Slaytı bir karton parçası gibi hareketli katı bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirin. Adım 6.7.6'da açıklandığı gibi kalan tüm slaytlara lamel ekleyin. Kızakların kurumasını ve montaj ortamının davlumbazdaki RT'de sertleşmesini bekleyin.
      DİKKAT: Kimyasal bir başlık altında çalışın.
  8. Boyamadan sonra, numuneleri bir lamel ile örtün ve optik mikroskop kullanarak değerlendirin. Histopatolojik değişiklikler dağılım, şiddet ve morfolojik özelliklere göre tanımlanmıştır.
  9. Shackelford ve ark.27 tarafından açıklanan ve aşağıdaki gibi özetlenen kriterlere dayalı olarak değişikliklerin ciddiyetini göz önünde bulundurarak, 5 puanlık bir değerlendirme ölçeği (0 ila 4) kullanarak yaralanma puanlamasını yarı kantitatif olarak gerçekleştirin:
    0. Derece: değişiklik yok
    1. Derece: minimum değişiklik. Etki doku üzerinde zar zor görülebilir; küçük ve seyrek. Dokunun %10'a eşit veya daha az bir kısmını etkiler.
    2. Derece: ışık değişimi. Küçük bir histolojik değişikliği temsil eder. Bu derece, doku veya yapısı hacimde %11 ile %20 arasında bir değişiklik gösterdiğinde kullanılır.
    3. Derece: ılımlı değişim. Değişim dokuda belirgindir. Derecesi, dokunun veya yapısının %21-%40'ı arasındaki varyasyonların varlığını gösterir
    4. Derece: belirgin değişiklik. Dokunun veya yapısının ezici histolojik değişimi. Varyasyonlar dokunun %41-100'ünü etkiler.
  10. Rahim, yumurtalık, testis ve tiroid üzerinde kantitatif histomorfometrik analiz yapın. Optik mikroskoba uygulanan bir görüntü analiz sistemi kullanarak doku kesitlerini inceleyin ve aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Rahim: 2x objektif kullanarak, sağ uterus boynuzunun her bir enine bölümünün, dış ve iç myometriumun ve uterus lümeninin toplam alanını ölçün. Endometriyum ve myometrium alanını ve endometriyum alanı ile myometrium28 arasındaki oranı hesaplayın.
    2. Yumurtalık: Gelişimin çeşitli aşamalarında folikülleri ortaya çıkarmak için yumurtalığın merkezi pozisyonunda tüm bölümlerden birini kullanın; 4x objektif kullanarak birincil, ikincil, korpus luteum, Graaf ve atrezik folikülleri sayın. Foliküllerin Fortune29'a göre sınıflandırılmasını gerçekleştirin. Ek olarak, her numune için yumurtalık alanını ve foliküler yoğunluğunu ölçün (folikül/yumurtalık alanı sayısı x 100)30.
    3. Testis: 10x objektifi kullanarak, 20 tübül / numune ölçün; Ek olarak, toplam lümen alanını, toplam alanı, uzunlamasına çapı ve enine çapı28 ölçün.
    4. Tiroid: Aşağıdaki parametreleri ölçün: foliküler yoğunluk (folikül sayısı ile belirli bir alan arasındaki oran, 10x objektif); dolaylı foliküler hücre yüksekliği (rastgele seçilen beş folikül / numunede folikül alanı ve kolloid alanın ortalama oranı 40x objektif); foliküler epitel alanlarının ve çekirdek sayısının ortalama oranı (foliküler olgunlaşmayı tespit etmek için aynı folikülde); foliküler hücre yüksekliği (rastgele seçilen beş folikül/numunedeki beş hücre yüksekliğinin ortalaması, 64x objektif)31.

7. Gen ifadesi

  1. Her iki model için de -80 °C'de saklanan karaciğer örneklerini kullanarak gen ekspresyon analizini gerçekleştirin. Hayvan dokusunun lizatından başlayarak bir kit kullanarak toplam RNA saflaştırma protokolünü takip edin.
    1. Karaciğer lizatını elde etmek için, doku örneğini (10 mg) bir minipinner ile öğütün, doku örneğine 600 μL RL BUFFER (kit ile birlikte verilir) ekleyin ve örnek homojenize olana kadar öğütmeye devam edin.
  2. Ekstraksiyondan hemen sonra, elde edilen RNA'yı ölçün ve bir florospektrometre kullanarak kalitesini (denatürasyon veya herhangi bir protein kalıntısının varlığı için) değerlendirin. Sırasıyla nükleik asitlerin ve proteinlerin emdiği 260 nm ve 280 nm dalga boylarında spektrofotometrik absorbans okumaları gerçekleştirin.
  3. Toplam RNA konsantrasyonunun değerlendirilmesinden sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Sentez Kiti kullanarak, her numuneden 1 μg toplam RNA içeren uygun hacmi cDNA'ya ters çevirin.
  4. Elde edilen cDNA'yı RT-PCR ile analiz edin.
    1. İlgilenilen genlerin gen ekspresyonlarını analiz etmek için, her bir hedef gen için ve ayrıca yapısal olarak eksprese edilen gliseraldehit fosfat dehidrojenaz (GAPDH) referans geni için spesifik ileri ve geri primerler tasarlanmıştır. Eşleştirmenin yalnızca ilgilenilen gene özgüllüğünü garanti edecek en iyi primerleri seçmek ve ticari bir tedarikçi tarafından sentezlenen oligonükleotidleri elde etmek için Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) web uygulamasını kullanın. Kullanılan primer çiftlerinin dizileri Tablo 5'te rapor edilmiştir.
    2. Liyofilize primerleri, 100 mM'lik bir nihai konsantrasyonda RNAse içermeyen damıtılmış su ile yeniden süspanse edin. qPCR analizi yapmak için özel bir kit kullanın. Reaksiyonları, tavlanmış cDNA'yı 1:40 seyrelterek 20 μL'lik bir son hacimde gerçekleştirin. Her numuneyi 96 oyuklu PCR plakalarına iki kopya halinde yükleyin.
    3. Bu programı izleyerek termal döngüleyici üzerinde qPCR çalıştırmaları gerçekleştirin: 10 dakika boyunca 95 °C'de 1 döngü; 95 ° C'de 15 saniye, 58 ° C'de 30 saniye ve 72 ° C'de 1 dakika boyunca 40 döngü. Sonunda, amplifiye edilmiş ürünün özgüllüğünü doğrulamak için 55 ° C ila 95 ° C (30 s / ° C) arasında bir ayrışma döngüsü gerçekleştirin. Makinenin özel yazılımını kullanarak, her numune için eşik döngü değerlerini (Döngü Eşiği, Ct) elde edin. Sonuçları Pfaffl formülü32'ye göre ΔΔ Ct (delta delta Ct) olarak ifade edin:
      ΔCt Hedef gen = Ct Kontrolü - Ct ile Tedavi Edildi
      ΔCt Referans geni = Ct Kontrolü - Ct ile Tedavi Edildi
      ΔCt = ΔCt Hedef gen - ΔCt Referans gen

8. Veri analizi

  1. Bir elektronik tablo kullanarak veri yönetimi gerçekleştirin. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak analiz yapın. Özel bir yazılım kullanarak grafik tasarlayın.
  2. Vücut ağırlığı kazancını, yem tüketimini, mutlak ve nispi organ ağırlığını, hormon serum seviyelerini, doku morfometrik verilerini ve gen ekspresyon verilerini ortalama ± standart sapma olarak temsil edin. Parametrik olmayan bir Kruskal-Wallis analizi ve ardından post-hoc ikili karşılaştırmalar yapın (Mann-Whitney testi).
  3. Şiddet derecelerine (toplam bulgu insidansı) herhangi bir atıfta bulunulmadan bir kategoriye atanan örnekler de dahil olmak üzere, Kontrol grubundan önemli farklılıkları belirlemek için 2 yönlü bir Fisher Kesin Testi kullanarak histolojik verileri analiz edin. Doz-yanıt eğilimini belirlemek için Cochran-Armitage Eğilim Testini kullanın. P değeri 0.05'< ise, gruplar arasındaki farklılıkları anlamlı olarak kabul edin.

Sonuçlar

Tassinari ve ark.14 ve Tammaro ve ark.33 tarafından gösterildiği gibi, aşağıdaki sonuçlar GAHT'nin sıçanlar üzerindeki başarısını ve modellerin uygunluğunu göstermiştir.

Saldırganlık gibi hiçbir mortalite veya anormal davranış kaydedilmez ve hiçbir klinik toksisite veya ıstırap belirtisi yoktur (ör., azalmış aktivite, piloereksiyon ve bakımsız bir görünüm)14

Tartışmalar

GAHT'yi taklit eden kemirgen modellerinin uygulanması, TG hastalarının potansiyel spesifik duyarlılığını ve savunmasızlığını ve genellikle tüm yaşamları boyunca süren tedavilerin uzun vadeli sonuçlarını incelemek için çok önemlidir.

Literatürdeki benzer çalışmaların az sayıda olduğu göz önüne alındığında, bu deneyin kritik noktası, modelleri ayarlamak için dozların seçimidir; Bu tür dozlar, yan etkilere, toksisiteye ve...

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel olarak çıkar çatışması yaratabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical balance ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuge 5415 REppendorfFor eppendorf
Cyproterone AcetateSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for WindowsGraphPad Software
HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Imaging SoftwareNikonNIS-BR
JMP 10 statistical softwareSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopyNikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Portable Balances SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesDesigned by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
SensiFASTcDNA Synthesis KitBiolineBIO-6505350 reaction
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley rats male and femaleEnvigo8/9 weeks old
Standard dietsMucedola4RF18
T4(Thyroxine) ELISA KitELK BiotechnologyELK871696T
Testosterone enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Tissue processorShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KITNorgen1720050 column
Victor 3 Multilabel reader Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631

Referanslar

  1. Rokach, A., Patel, K. . Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. . Gender Dysphoria. , (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343 (2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877 (2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. &. #. 8. 2. 1. 7. ;., Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640 (2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. . Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002 (2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474 (2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839 (2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716 (2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5 (2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013 (2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183 (2024).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Cinsiyeti Onaylayan Hormon Tedavisi GAHTTransseks el TG ModellerS an ModelleriDemask lile tirici Di ile tirici Model dMFDefeminizan Erkekle tirici Model dFMHormonal UygulamaBiyokimyasal AnalizMolek ler AnalizHistopatolojik AnalizCinsiyete zg ParametrelerCYP450 zoformlarTiroid TutulumuRisk De erlendirmesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır