Establecimiento de modelos de ratas que imitan las terapias hormonales de afirmación de género

Resumen

El protocolo describe el desarrollo de dos modelos de roedores que imitan las terapias hormonales de afirmación de género mediante la administración subcutánea de testosterona o estradiol más acetato de ciproterona (utilizado en terapias humanas para personas transgénero): ajuste de las dosis, identificación de biomarcadores relevantes y evaluación de los efectos.

Resumen

Las personas transgénero (TG) son individuos cuya identidad de género y sexo asignados al nacer no coinciden. A menudo se someten a la terapia hormonal de afirmación de género (GAHT), una intervención médica que permite la adquisición de características sexuales secundarias más alineadas con su identidad de género individual, proporcionando resultados consistentes en la mejora de numerosas variables sociopsicológicas. Sin embargo, el GAHT se dirige a diferentes sistemas corporales, y se han registrado algunos efectos secundarios, aunque aún no se han identificado y caracterizado por completo. Por lo tanto, las personas TG sometidas a GAHT pueden considerarse como un subgrupo susceptible de la población y se debe prestar especial atención en el marco de la evaluación de riesgos, por ejemplo, mediante el uso de modelos animales específicos. El presente trabajo describe los procedimientos establecidos para implementar dos modelos de ratas que imitan el GAHT: el modelo desmasculinizante-feminizante (dMF) que imita el GAHT para mujeres TG y el modelo desfeminizante-masculinizante (dFM) que imita el GAHT para hombres TG. Los modelos se han implementado mediante la administración de las mismas hormonas utilizadas para el GAHT humano, a saber, β-estradiol más acetato de ciproterona para el dMF y testosterona para el dFM, por las mismas vías de exposición durante un período de 2 semanas. Las ratas se examinan diariamente durante el tratamiento para evaluar el estado de salud y los comportamientos potencialmente agresivos. En el momento del sacrificio, se han tomado muestras de sangre y tejidos objetivo y se han almacenado para su análisis bioquímico, molecular e histopatológico. También se han evaluado los parámetros específicos del sexo, es decir, el recuento de espermatozoides y las dimensiones del clítoris. Además, las isoformas de CYP450, expresadas exclusiva y/o preferentemente en hígado de rata macho y hembra, se identifican y caracterizan como nuevos biomarcadores para verificar el éxito de GAHT y establecer el modelo. La afectación de la tiroides también se ha explorado como un objetivo clave en el sistema endocrino.

Introducción

La percepción psicológica del individuo de ser hombre, mujer, ninguno, ambos o en algún punto intermedio¹ se llama identidad de género. Puede coincidir con el sexo biológico (cisgénero) o puede ser diferente (transgénero - TG). Un hombre TG es un individuo nacido como mujer pero que se identifica como hombre. Una mujer TG nace como hombre pero se identifica como mujer². Se estima que, en la actualidad, hay 25 millones de personas TG en todo el mundo^3, la mayoría de las cuales padecen disforia de género, una condición psicológica caracterizada por la incongruencia entre su género y el que se les asignó al nacer⁴, lo que puede resultar en discriminación social y dificultades en el trabajo y en la familia, a menudo conduciendo a la depresión. ansiedad y estrés⁵. Por estas razones, las personas TG a menudo se someten a la terapia hormonal de afirmación de género (GAHT) y/o a la cirugía de afirmación de género. La GAHT para los hombres TG se caracteriza por la administración de testosterona (T) (Tabla 1), y para las mujeres TG, estrógenos (E2) más antiandrógenos (Tabla 2)⁶.

La GAHT suele durar toda la vida del individuo, actuando de forma continua sobre el sistema endocrino ^7,8. Por lo tanto, es importante analizar el impacto del GAHT en la salud de las personas TG y sus posibles efectos duraderos. Además, las personas TG están expuestas, al igual que la población general, a contaminantes químicos, en particular, los disruptores endocrinos (DE), que se dirigen al sistema endocrino como GAHT, lo que resulta en una sobreestimulación^.

Los TCA son un grupo de sustancias químicas que afectan a los organismos y/o a su progenie alterando diferentes procesos hormonales y metabólicos, como la secreción, activación, síntesis, liberación y unión de hormonas naturales. Dado que los TCA están muy extendidos en el medio ambiente, los alimentos y productos de uso cotidiano (por ejemplo, botellas y recipientes de plástico, revestimientos de latas metálicas de alimentos, detergentes, retardantes de llama, alimentos, juguetes, cosméticos y pesticidas, etc.) la población general está continuamente expuesta durante toda la vida¹⁰. Además, incluso la exposición a dosis bajas de DE puede provocar daños en tejidos y órganos, y un fenómeno común asociado con la exposición a DE es la aparición de efectos específicos del sexo tanto en animales de laboratorio como en humanos¹¹. Por ejemplo, la exposición al material en contacto con alimentos, el bisfenol A (BPA), está relacionada con riesgos para la salud, como la endometriosis y el síndrome de ovario poliquístico en las mujeres, así como con la reducción de la fertilidad, debido a sus efectos estrogénicos¹². En los hombres, el BPA puede reducir los niveles y disminuir la calidad del esperma¹³. Además, los pesticidas se asocian con un mayor riesgo de cáncer de mama en las mujeres y problemas significativos de fertilidad^{en los hombres}. Hasta el momento, no se dispone de herramientas específicas para estudiar los efectos toxicológicos de los contaminantes ambientales, incluida la disfunción eréctil, en las personas TG⁹.

El presente estudio tiene como objetivo describir los métodos y parámetros seleccionados para el desarrollo de dos modelos animales TG: un modelo desmasculinizante-feminizante (dMF) y un modelo desfeminizante-masculinizante (dFM). En particular, se evalúa la selección de los niveles de dosis adecuados, el tiempo y la forma de administración de las hormonas sobre la base de las terapias humanas actuales¹⁴. Además, se identifican y caracterizan los biomarcadores tisulares y funcionales que definen los modelos de forma única. Además, se describe en detalle la eficacia y tolerabilidad de la terapia en animales, así como la selección de los marcadores más adecuados para su uso en estudios a largo plazo, junto con las técnicas utilizadas para tales fines.

Para caracterizar los modelos, se analizan los siguientes criterios de valoración: nivel sérico de testosterona (T) (el mejor biomarcador para evaluar el éxito de la GAHT en ambos modelos ^9,15); nivel sérico de estradiol (E2) (ambos modelos); hormona estimulante de la tiroides (TSH) y tiroxina (T4) (modelo dMF); recuento de espermatozoides (modelo dMF); dimensión del clítoris (modelo dFM); Análisis histopatológico de los órganos reproductores, hígado y tiroides (para ambos modelos). Además, también se analiza la expresión génica de las siguientes isoformas del citocromo p450 hepático específico del sexo (CYP450s, para ambos modelos)^16,17: CYP2C11 (expresado específicamente en el hígado masculino), CYP3A18 (expresado 25 veces más en el hígado masculino que en el femenino), CYP2C12 (expresado específicamente en el hígado femenino) y CYP2C6 (expresado predominantemente en el hígado femenino, pero presente en niveles más bajos, también en el varón).

Protocolo

Los estudios se realizan siguiendo la Directiva 2010/63/UE, el Decreto Legislativo italiano n. 26 del 4 de marzo de 2014 y los Principios de Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) de la OCDE. El protocolo del estudio fue aprobado por el Ministerio de Salud italiano (autorización n.º 806/2021-PR). Aquí, se compran 16 ratas Sprague-Dawley jóvenes sexualmente maduras de ambos sexos (304 ± 13 g de ratas macho y 190 ± 7 ratas hembras, de 8-9 semanas de edad) y se alojan en dos jaulas en condiciones estándar de laboratorio (22 ± 0,5 °C, 50%-60% de humedad relativa, 12 h de alternancia de luz oscura con 12-14 cambios de aire por hora) con agua y alimento disponibles ad libitum. En todas las jaulas, para el enriquecimiento ambiental de cada animal, inserte bloques de madera para roer y reemplácelos semanalmente.

NOTA: Se han elegido los animales de 8 a 9 semanas de edad, ya que el GAHT puede comenzar durante la adolescencia (etapas de Tanner 2 a 3), correspondientes a 8-9 semanas en roedores, y dura mucho tiempo, potencialmente durante toda la vida de las personas TG⁹.

1. Dimensionamiento del grupo y cuidado de los animales

1. Utilice ratas Sprague-Dawley adultas jóvenes macho y hembra (8-9 semanas de edad) como modelo, ya que la rata es la especie preferida indicada por la OCDE (por ejemplo, la Directriz 421 Prueba de Detección de Toxicidad Reproductiva/del Desarrollo) y la única especie de roedores propuesta y considerada en la Directriz 407 de la OCDE (estudio de toxicidad oral de 28 días a dosis repetidas en roedores, actualizado con los parámetros para la detección de IE).
2. Utilice el software G*Power para el dimensionamiento del grupo. Para los modelos dFM y dMF, seleccione cuatro grupos de prueba: un grupo de control (C) y tres grupos de animales tratados con diferentes dosis de GAHT. Realizar el dimensionamiento con referencia a la comparación entre dos grupos (dosis de tratamiento versus C) con la prueba de Mann-Whitney, un nivel de significancia de dos colas alfa = 0,0167 (correspondiente a alfa = 0,05 con corrección de Bonferroni aplicada a las 3 comparaciones entre cada dosis de tratamiento y la C), y potencia 1-beta = 0,80.
   1. El número calculado de ratas/grupos es el siguiente:
      para el modelo de DM, animales/grupo n=4, según Kinnear et ^al.18 indicando después de 2 semanas de tratamiento, los siguientes niveles: en el grupo control: 0,2 ± 0,3 ng/mL, en el grupo de terapia hormonal: 16 ± 5 ng/mL (media ± desviación estándar), correspondiente a una dimensión del efecto medida con d de Cohen = 4,46 (efecto muy grande).
      para el modelo dMF: animales/grupo n=3, según Gómez et ^al.19 indicando después de 2 semanas de tratamiento, los siguientes niveles: grupo control: 1,901 ± 0,413 ng/mL y grupo de terapia hormonal: 0,043 ± 0,023 ng/mL (media ± error estándar) correspondiente a una dimensión del efecto medida con d de Cohen = 6,35 (efecto muy grande).
   2. Para alinear los dos modelos, elija n = 4 animales por sexo/grupo, para un total de N = 32 animales.
3. Después de 1 semana de aclimatación, dividir las ratas por sexo en dos grupos experimentales (dMF y dFM, 4 ratas/grupo), cada uno compuesto por un C (macho control, CM y hembra control, CF) y tres grupos de tratamiento del GAHT seleccionado.
4. Monitoree todas las ratas 2 veces al día (a las 8:30 a.m. y a las 4:00 p.m.) para verificar las condiciones generales de salud y la posible agresividad debido a la administración de GAHT. Registre el peso corporal (pc) y el consumo de alimento 2 veces por semana, utilizando una balanza analítica con la función de ponderación dinámica óptima para el peso de los animales de laboratorio.
5. En el modelo experimental dFM, se midió el diámetro del clítoris de todas las ratas inmediatamente antes del inicio del tratamiento (punto 0) y al final del tratamiento (punto 13), utilizando un medidor digital para lecturas de precisión.
6. Pesar a todos los animales antes del sacrificio y, en el modelo dMF, inmediatamente después del sacrificio retirar el epidídimo para realizar el recuento de espermatozoides.

2. Selección y preparación de la dosis

1. Utilice las siguientes tres dosis de hormonas para administrar a las ratas dFM: 5, 10,5 y 22,5 mg/kg por semana, para el modelo dMF, utilice los siguientes tres niveles de dosis seleccionados (DL): DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg y DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
   NOTA: Todas las dosis se seleccionan teniendo en cuenta las principales guías clínicas humanas utilizadas para las personas TG¹⁵ y los limitados datos disponibles en la literatura.
2. Prepare todas las soluciones madre semanalmente con una campana de seguridad química. Mezclar adecuadamente todas las sustancias en el aceite de sésamo como un vehículo, asegurando su completa solubilización.
   NOTA: Para ambos modelos, use una calculadora de conversión de dosis (https://dosecal.cftri.res.in/) para ingresar la dosis a convertir, la especie para la cual se ha establecido la dosis, la especie animal y el peso para el cual se debe convertir la dosis. Para el modelo de dFM (Tabla 3), terapia hormonal humana, una dosis máxima de 100 mg de T por semana²⁰. La dosis calculada en ratas es de 10,5 mg/kg de T por semana. La segunda dosis es de 22,5 mg/kg por semana en ratas¹⁸. La tercera dosis es de 5 mg/kg por semana, identificada manteniendo el factor de 2,1 entre las dos dosis calculadas. Para el modelo de DMdMF, ver Tabla 4, las dosis se basan en los regímenes recomendados para humanos²¹ y los datos disponibles a través de estudios in vivo 14,19,22.

3. Trato a los animales

1. Realizar la administración subcutánea de T (para el modelo dFM) y E2 plus CPA (para el modelo dMF) pellizcando y levantando la piel en el lugar de la inyección, formando una especie de cortina. A continuación, inserte la aguja de una jeringa de 1 ml paralela al lomo del animal. Una vez dentro, inyectar lentamente el volumen requerido (100 μL para T; 200 μL para E2+CPA)²³.
   1. Tratar a los animales de la siguiente manera: para el modelo dFM, administrar enantato de T disuelto en aceite de sésamo (vehículo) 2 veces por semana durante 2 semanas (100 μL por cada inyección subcutánea de T). Para el modelo dMF, administrar E2 más acetato de CPA disuelto en aceite de sésamo (vehículo) 5 veces por semana durante 2 semanas (200 μL por cada inyección subcutánea). Trate a las ratas del grupo C de la misma manera que el vehículo solo (aceite de sésamo).

4. Muestreo de sangre, sacrificio y muestreo de tejidos

1. Después de 2 semanas de tratamiento, justo antes del sacrificio, use un sistema de anestesia gaseosa y anestesiar a todos los animales. Inducir la anestesia mediante dosis que varían del 2% al 3,5% de isoflurano en oxígeno al 100% a razón de 1,5 L/min hasta la pérdida de los reflejos en una cámara de inducción de poliestireno transparente. Coloque a la rata en posición prona sobre la almohadilla térmica y regule la dosis de isoflurano a una dosis de mantenimiento que varíe del 1,5% al 3,5% administrada por una mascarilla nasal estándar para ratas durante todo el procedimiento de muestreo de sangre intracardíaca.
2. Prepare una jeringa de 5 mL con una aguja de 21G, eliminando el vacío. Sondeando el corazón con los dedos, inserte cuidadosamente la aguja en la pared torácica lateral perpendicular al cuerpo aproximadamente en el punto de los codos flexionados, entre las costillas 5 y 6. Una vez dentro del ventrículo cardíaco, la sangre entra en la jeringa por capilaridad. Retraiga el pistón de la jeringa lenta y continuamente hasta que se extraiga sangre.
3. Después de la toma de muestras de sangre, coloque las ratas en la cámara de CO₂ para realizar la eutanasia mediante asfixia con CO₂ con una tasa de llenado del 30% al 70% de desplazamiento del volumen de la cámara por minuto. Después de 2-3 min, verifique la muerte de los animales monitoreando la respiración y los latidos del corazón²⁴.
4. Después del sacrificio, coloque a todos los animales en la mesa de disección en posición supina, con las patas delanteras hacia arriba y las traseras hacia abajo, y fíjelos con alfileres. Espolvorea el abdomen del animal con una solución desinfectante.
5. Extirpar los siguientes órganos: testículos, epidídimo, útero, ovarios, hígado y tiroides. Pesarlos y almacenarlos en tubos de 50 mL con 35 mL de formalina tamponada al 10% (todos los órganos) o solución de Bouin (solo testículos) o recogerlos en tubos criogénicos (un órgano/tubo) y congelarlos inmediatamente en nitrógeno líquido (para almacenar a -80 °C).
   1. En primer lugar, corte la piel con unas tijeras en la línea media, desde el pubis hasta la parte superior del abdomen. Haga dos cortes laterales en la caja torácica y refleje la piel a ambos lados de la incisión para exponer las vísceras torácicas.
   2. Extirpe primero los órganos reproductivos; En ratas macho, se extirpan los testículos, órganos pareados de forma ovalada situados en la cavidad abdominal, en posición intraabdominal (saco escrotal). Corta y presiona el saco escrotal para asegurarte de que los testículos sobresalgan, luego agárralos suavemente. Sostenga la grasa visceral con unos alicates, luego corte los testículos lejos de las vísceras. Después de la escisión, pesar y almacenar los testículos en la solución de Bouin para el análisis histopatológico.
   3. En ratas hembras, primero se agarra el útero con delicadeza, luego se cortan los ovarios (que se encuentran al final de ambos cuernos uterinos) del tejido adiposo visceral. Después de la extirpación, pesa los ovarios.
   4. Tanto en ratas hembras como machos, se desplazan hacia el lado derecho de la cavidad abdominal, donde se encuentra el hígado. El hígado es un órgano multilobulado y es posible identificar muchas partes: medial izquierdo (más pequeño), lateral izquierdo (mayor), medial derecho (más pequeño), lateral derecho (mayor), caudado y lóbulo cuadrado²⁵. Agarre el hígado con fórceps, teniendo cuidado de no romperlo. Sujete la apófisis xifoides con unos alicates y corte completamente el diafragma con unas tijeras.
   5. Use fórceps para levantar la apófisis xifoides y extraer el hígado de la cavidad abdominal. Separe el hígado del diafragma con unas tijeras. Después de eso, pese el hígado y guárdelo.
   6. Para la extracción de la tiroides, con la ayuda de unas tijeras, corte perpendicularmente a lo largo del cuello del animal, retire la piel y la musculatura, y recorte suavemente los extremos de la tráquea, en la que se encuentra la glándula tiroides. Guarde la tiroides para su posterior análisis²⁶.
6. Realice el recuento de espermatozoides como se describe a continuación.
   1. Después de la extirpación de los testículos, agarre el epidídimo, que está unido al margen posterior del testículo respectivo y contenido en el escroto.
   2. En este experimento, se toman muestras de semen de la cola del epidídimo derecho. En el momento de la recolección, limpie la cola de grasa y tejido conectivo con unas tijeras, sepárela de la parte restante y colóquela en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contenga 1 mL de DMEM. Cortar con tijeras y fluir con una pipeta Pasteur para facilitar la liberación del contenido.
   3. Transfiera todo el líquido obtenido a un tubo de 15 mL y lleve el volumen a 10 mL con DMEM (factor de dilución 1:10 = 0,1). Pipetear el contenido para homogeneizar y crear una suspensión. Después de una ligera sacudida, tome 10 μL de la suspensión para cargar la cámara de Neubauer. Cargue la cámara y después de 3 minutos de carga de la cámara, comience el conteo.

5. Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

1. Recoja muestras de sangre (alrededor de 2-5 mL por animal) en tubos de 2 mL y deje que se coagulen a temperatura ambiente durante 1 h. Centrifugar todas las muestras de sangre 2 veces durante 15 minutos a 4 °C y 3000 x g.
2. La sangre centrifugada tiene una apariencia de múltiples capas con tres capas de diferentes colores. La capa superior está formada por plasma (generalmente amarillo o transparente), la porción líquida de la sangre; la capa debajo del plasma puede tener una coloración blanquecina o gris y es el pelaje leucocitario. La capa más baja contiene glóbulos rojos y el color puede aparecer rojo oscuro o rojo brillante. Para determinar los niveles de hormonas sexuales, recoja el suero de todas las muestras con una pipeta (sin tocar la capa leucocitaria ni las capas de eritrocitos), divídalas en alícuotas (500 μL) y guárdelas a -80 °C.
3. En ambos modelos, se realiza la prueba ELISA para detectar y/o medir la presencia de proteínas, anticuerpos o antígenos en la muestra para la determinación de hormonas sexuales. Utilice el método directo y siga las instrucciones de cada kit ELISA. En este estudio, se determinaron los niveles séricos de las siguientes hormonas en ratas: E2, Rata Estradiol ELISA; T, ratón/rata testosterona Elisa; TSH, Kit ELISA para Ratas y T4, Kit ELISA para Ratas.

6. Análisis histopatológico

1. Preparar portaobjetos histológicos de tejidos de acuerdo con los siguientes procedimientos.
2. Fijar las muestras de útero, ovario, tiroides e hígado en el momento de la extracción en formol tamponado al 10% durante al menos 48 h.
   PRECAUCIÓN: Trabaje bajo una cubierta química. No inhale la sustancia/mezcla. Evite generar vapores/aerosoles.
3. Lavar las muestras con agua corriente durante 1 h y luego almacenarlas en alcohol etílico al 80% (C₂H₅OH) hasta el procesamiento, para preservar la estructura protoplasmática de las alteraciones resultantes de la muerte celular.
4. Fijar el testículo en la solución de Bouin compuesta por 15 mL de solución saturada de ácido pícrico, 5 mL de formalina concentrada (33%-40%) y 1 mL de ácido acético glacial durante 48 h. Lave las muestras con alcohol etílico al 80%.
   PRECAUCIÓN: Trabaje bajo una cubierta química.
5. Realice la inclusión en parafina sólida utilizando un procesador automático de tejidos. Al final del proceso de inclusión, coloque las muestras en pequeños recipientes metálicos en los que se haya vertido parafina derretida y enfríe en una placa congelada, formando los bloques para el corte. Oriéntelos en función de la sección de corte deseada.
6. Después de eso, corte las muestras con un micrótomo giratorio. Recoja secciones de 5-6 μm con pinceles pequeños, extiéndalas en agua a 37 °C durante unos segundos y colóquelas en portaobjetos de vidrio de microscopio. Dejar escurrir los portaobjetos perpendicularmente durante unos minutos y secarlos en el horno a 36 °C durante al menos 1 h.
7. Realice la tinción de hematoxilina y eosina como se describe a continuación.
   1. Desparafinar los portaobjetos sumergiéndolos en un agente limpiador de origen terpénico (sustituto del xileno) durante 5 min.
   2. Rehidrate los portaobjetos sumergiéndolos en la siguiente serie de etanol graduado. Para cada solución, 2 minutos por inmersión: 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol, 50% etanol y agua destilada.
      NOTA: Puede ser un punto de parada para el protocolo, y los portaobjetos se pueden dejar en RT en el agua durante varias horas. Opcionalmente, los portaobjetos también se pueden almacenar a 4 °C en agua.
   3. Coloque los portaobjetos en la hematoxilina de Mayer durante 5 min. Transfiéralos inmediatamente al recipiente con agua del grifo durante 5 minutos. Deje correr el agua del grifo en la esquina trasera del recipiente más alejada de las secciones. Vacíe periódicamente el recipiente hasta que el colorante púrpura del agua ya no esté presente.
      NOTA: Para evitar que las secciones se despeguen de los portaobjetos, no deje correr el agua directamente sobre los portaobjetos.
   4. Coloque los portaobjetos en la solución acuosa de eosina Y 1% durante 2 min. Transfiera los portaobjetos a agua destilada durante 15 s. Deshidrate los portaobjetos sumergiéndolos en la siguiente serie de etanol graduado. Para cada solución, 15 s por inmersión: 50% etanol, 80% etanol, 95% etanol.
   5. Coloque los portaobjetos en etanol al 100% durante 1 minuto y cámbielo a etanol al 100% fresco durante 1 minuto más. Coloque los portaobjetos en un agente de limpieza de origen terpénico (sustituto del xileno) durante 2 minutos y cámbielo por un agente de limpieza fresco de origen terpénico (sustituto del xileno) durante otros 2 minutos. Retire un portaobjetos a la vez y coloque un cubreobjetos.
   6. Cubra las secciones con medio de montaje y coloque un cubreobjetos en la parte inferior del portaobjetos.
      NOTA: Asegúrese de que el medio de montaje tire de la corredera a su posición. Si el cubreobjetos no es plano, golpéelo suavemente en su lugar. Seque el exceso de medio de montaje con una toalla de papel.
   7. Sumerja una toallita limpiadora en el agente limpiador de origen terpénico (sustituto del xileno) y limpie la parte posterior del portaobjetos para eliminar el medio goteado. Coloque la diapositiva plana sobre una superficie sólida móvil, como un trozo de cartón. Agregue cubreobjetos a todas las portaobjetos restantes como se describe en el paso 6.7.6. Deje que las correderas se sequen y que el medio de montaje se endurezca en RT en el capó.
      PRECAUCIÓN: Trabaje bajo una cubierta química.
8. Después de la tinción, cubra las muestras con un cubreobjetos y evalúelas con un microscopio óptico. Los cambios histopatológicos se han descrito en función de la distribución, la gravedad y las características morfológicas.
9. Realizar la puntuación de las lesiones de forma semicuantitativa, utilizando una escala de valoración de 5 puntos (0 a 4), considerando la gravedad de los cambios en base a los criterios explicados por Shackelford et ^al.27 y resumidos de la siguiente manera:
   Grado 0: sin cambios
   Grado 1: cambio mínimo. El efecto es apenas visible en el tejido; pequeño y poco frecuente. Afecta a una porción de tejido menor o igual al 10%.
   Grado 2: cambio de luz. Representa un pequeño cambio histológico. Este grado se utiliza cuando el tejido, o su estructura, ha mostrado un cambio de volumen entre el 11% y el 20%.
   Grado 3: cambio moderado. El cambio es evidente en el tejido. El grado indica la presencia de variaciones entre el 21%-40% del tejido o su estructura
   Grado 4: cambio marcado. Cambio histológico abrumador del tejido o de su estructura. Las variaciones afectan al 41%-100% del tejido.
10. Realizar análisis histomorfométricos cuantitativos en útero, ovario, testículo y tiroides. Examine las secciones de tejido utilizando un sistema de análisis de imágenes aplicado a un microscopio óptico y siga los pasos que se describen a continuación.
    1. Útero: Con un objetivo 2x, mida el área total de cada sección transversal del cuerno uterino derecho, el miometrio externo e interno y la luz uterina. Calcula el área del endometrio y el miometrio y la relación entre el área del endometrio y el miometrio²⁸.
    2. Ovario: Utilice una de las secciones completas en la posición central del ovario para revelar folículos en varias etapas de desarrollo; contar los folículos primarios, secundarios, cuerpo lúteo, Graaf y atresicos utilizando un objetivo 4x. Realizar la clasificación de los folículos según Fortune²⁹. Además, mida el área del ovario para cada muestra y su densidad folicular (número de folículos/área ovárica x 100)³⁰.
    3. Testículos: Usando el objetivo 10x, mida 20 túbulos/muestra; Además, mida el área total del lumen, el área total, el diámetro longitudinal y el diámetro transversal²⁸.
    4. Tiroides: Mida los siguientes parámetros: densidad folicular (relación entre el número de folículos y un área determinada, objetivo 10x); altura indirecta de las células foliculares (relación media del área del folículo y el área coloide en cinco folículos seleccionados al azar/muestra 40x objetivo); la relación media de las áreas de epitelio folicular y el número de núcleos (en el mismo folículo para determinar la maduración folicular); Altura de las células foliculares (media de cinco alturas de las células en cinco folículos/muestra seleccionados al azar, objetivo 64x)³¹.

7. Expresión génica

1. Para ambos modelos, realice el análisis de expresión génica utilizando muestras de hígado almacenadas a -80 °C. Siga el protocolo de purificación de ARN total utilizando un kit, a partir de un lisado de tejido animal.
   1. Para obtener el lisado hepático, triture la muestra de tejido (10 mg) con un minipinner, añada 600 μL de RL BUFFER (suministrado con el kit) a la muestra de tejido y continúe moliendo hasta que la muestra se haya homogeneizado.
2. Inmediatamente después de la extracción, cuantificar el ARN obtenido y evaluar su calidad (para la desnaturalización o la presencia de cualquier residuo de proteína) utilizando un fluorespectrómetro. Realice lecturas espectrofotométricas de absorbancia en longitudes de onda de 260 nm y 280 nm, donde los ácidos nucleicos y las proteínas absorben respectivamente.
3. Después de la evaluación de la concentración total de ARN, utilizando un kit de síntesis de ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante, transcriba inversamente el volumen apropiado que contenga 1 μg de ARN total de cada muestra a ADNc.
4. Analizar el ADNc obtenido por RT-PCR.
   1. Para analizar las expresiones génicas de los genes de interés, se han diseñado cebadores directos e inversos específicos para cada gen diana, así como para el gen de referencia expresado constitutivamente por la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Utilice la aplicación web Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) para elegir los mejores cebadores que garanticen la especificidad del emparejamiento solo para el gen de interés y obtener los oligonucleótidos sintetizados por un proveedor comercial. Las secuencias de los pares de cebadores utilizados se presentan en el Cuadro 5.
   2. Vuelva a suspender los cebadores liofilizados con agua destilada libre de ARNasa a una concentración final de 100 mM. Utilice un kit dedicado para realizar análisis de qPCR. Llevar a cabo las reacciones en un volumen final de 20 μL, diluyendo el ADNc recocido 1:40. Cargue cada muestra por duplicado en placas de PCR de 96 pocillos.
   3. Realice ejecuciones de qPCR en termociclador siguiendo este programa: 1 ciclo a 95 °C durante 10 min; 40 ciclos a 95 °C durante 15 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min. Al final, realice un ciclo de disociación de 55 °C a 95 °C (30 s/°C) para verificar la especificidad del producto amplificado. Utilizando el software dedicado de la máquina, obtenga los valores de ciclo umbral (Umbral de ciclo, Ct) para cada muestra. Exprese los resultados como ΔΔ Ct (delta delta Ct) según la fórmula de Pfaffl³²:
      ΔCt Gen diana = Control de Ct - Tratamiento con Ct
      Gen de referencia ΔCt = Control de Ct - Tratamiento con Ct
      ΔCt = ΔCt Gen diana - ΔCt Gen de referencia

8. Análisis de datos

1. Realice la gestión de datos mediante una hoja de cálculo. Realizar análisis utilizando software de análisis estadístico. Diseño de gráficos utilizando software específico.
2. Representa la ganancia de peso corporal, el consumo de alimento, el peso absoluto y relativo de los órganos, los niveles séricos de hormonas, los datos morfométricos de los tejidos y los datos de expresión génica como media ± desviación estándar. Realizar un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido de comparaciones post-hoc por pares (prueba de Mann-Whitney).
3. Analice los datos histológicos utilizando una prueba exacta de Fisher de 2 vías para identificar diferencias significativas con respecto al grupo de control, incluidas las muestras asignadas a una categoría sin ninguna referencia a las gradaciones de gravedad (incidencia total de hallazgos). Utilice la prueba de tendencia de Cochran-Armitage para identificar la tendencia dosis-respuesta. Considere las diferencias entre los grupos como significativas si el valor p es < 0,05.

Resultados

Como demostraron Tassinari et ^al.14 y Tammaro et ^al.33, los siguientes resultados mostraron el éxito de la GAHT en ratas y la idoneidad de los modelos.

No se registran muertes ni comportamientos anormales, como agresividad, y no se observan signos clínicos de toxicidad o sufrimiento (por ejemplo, disminución de la actividad, piloerección y aspecto despeinado)¹⁴.

Discusión

La implementación de modelos de roedores que imiten el GAHT es crucial para estudiar la posible susceptibilidad específica y vulnerabilidad de las personas TG y los resultados a largo plazo de las terapias, que suelen durar toda su vida.

Dado el escaso número de estudios similares en la literatura, el punto crítico de este experimento es la selección de las dosis para establecer los modelos; Dichas dosis deben ser lo suficientemente bajas como para ser co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical balance ABJ 320-4NM	Kern	Z741091
Bouin	Biooptica	05-M01008
Centrifuge 5415 R	Eppendorf		For eppendorf
Cyproterone Acetate	Sigma-Aldrich	C3412
D-MEM medium	Gibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXN	Smobio	TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for Windows	GraphPad Software
Hematoxylin	Biooptica	05-06002/L
Heosin	Biooptica	05-10007/L
Imaging Software	Nikon		NIS-BR
JMP 10 statistical software	SAS Institute
Microm	Thermo Scientific	HM 325
Microscopy	Nikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISA	Biovendor	RTC001R	96T
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		ND-1000
Paraffina	Biooptica	087910
Portable Balances SCOUT STX2202	OHAUS	30253064
Primers	Life Technologies		Designed by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISA	Biovendor	RTC009R	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
SensiFASTcDNA Synthesis Kit	Bioline	BIO-65053	50 reaction
Sesam Oil	ACROS	AC241000010
Sprague Dawley rats male and female	Envigo		8/9 weeks old
Standard diets	Mucedola	4RF18
T4(Thyroxine) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK8716	96T
Testosterone enanthate	Sigma-Aldrich	T3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus Bioer	Aurogene
Tissue processor	Shandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KIT	Norgen	17200	50 column
Victor 3 Multilabel reader	Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerate	Sigma-Aldrich	E1631