Mise en place de modèles de rats imitant les thérapies hormonales d’affirmation de genre

Résumé

Le protocole décrit le développement de deux modèles de rongeurs imitant les thérapies hormonales d’affirmation de genre par l’administration sous-cutanée de testostérone ou d’œstradiol plus acétate de cyprotérone (utilisé dans les thérapies humaines pour les personnes transgenres) : fixation des doses, identification des biomarqueurs pertinents et évaluation des effets.

Résumé

Les personnes transgenres (TG) sont des personnes dont l’identité de genre et le sexe assigné à la naissance ne correspondent pas. Ils subissent souvent une hormonothérapie d’affirmation de genre (GAHT), une intervention médicale qui permet l’acquisition de caractéristiques sexuelles secondaires plus alignées avec leur identité de genre individuelle, fournissant des résultats cohérents dans l’amélioration de nombreuses variables socio-psychologiques. Cependant, le GAHT cible différents systèmes corporels, et certains effets secondaires sont enregistrés, bien qu’ils ne soient pas encore entièrement identifiés et caractérisés. Par conséquent, les personnes TG subissant une GAHT peuvent être considérées comme un sous-groupe sensible de la population et une attention particulière doit être accordée dans le cadre de l’évaluation des risques, par exemple par l’utilisation de modèles animaux ciblés. Le présent travail décrit les procédures mises en place pour mettre en œuvre deux modèles de rats imitant le GAHT : le modèle démasculinisant-féminisant (dMF) imitant le GAHT pour les femmes TG et le modèle déféminisant-masculinisant (dFM) imitant le GAHT pour les hommes TG. Les modèles ont été mis en œuvre par l’administration des mêmes hormones que celles utilisées pour le GAHT humain, à savoir le β-estradiol plus l’acétate de cyprotérone pour le dMF et la testostérone pour le dFM, par les mêmes voies d’exposition pendant une période de 2 semaines. Les rats sont contrôlés quotidiennement pendant le traitement pour évaluer leur état de santé et leurs comportements potentiellement agressifs. Au moment du sacrifice, le sang et les tissus cibles ont été prélevés et stockés pour des analyses biochimiques, moléculaires et histopathologiques. Des paramètres spécifiques au sexe, à savoir le nombre de spermatozoïdes et les dimensions clitoridiennes, ont également été évalués. De plus, les isoformes du CYP450, exprimées exclusivement et/ou préférentiellement dans le foie de rat mâle et femelle, sont identifiées et caractérisées comme de nouveaux biomarqueurs afin de vérifier le succès de la GAHT et d’établir le modèle. L’implication de la thyroïde a également été explorée comme une cible clé dans le système endocrinien.

Introduction

La perception psychologique de l’individu d’être un homme, une femme, ni l’un ni l’autre, les deux ou quelque part entre les deux¹ s’appelle l’identité de genre. Il peut correspondre au sexe biologique (cisgenre) ou être différent (transgenre - TG). Un homme TG est un individu né en tant que femme mais qui s’identifie comme un homme. Une femme TG naît en tant qu’homme mais s’identifie comme une femme². On estime qu’à l’heure actuelle, il y a 25 millions de personnes TG dans le monde³, la plupart d’entre elles souffrant de dysphorie de genre, un état psychologique caractérisé par une incongruence entre leur genre et celui qui leur a été attribué à la naissance⁴, qui peut entraîner une discrimination sociale et des difficultés au travail et dans la famille, conduisant souvent à la dépression. anxiété et stress⁵. Pour de telles raisons, les personnes TG subissent souvent une hormonothérapie d’affirmation de genre (GAHT) et/ou une chirurgie d’affirmation de genre. La GAHT chez les hommes TG est caractérisée par l’administration de testostérone (T) (tableau 1), et chez les femmes TG, d’œstrogènes (E2) et d’antiandrogènes (tableau 2)⁶.

Le GAHT dure généralement toute la vie de l’individu, agissant en permanence sur le système endocrinien ^7,8. Il est donc important d’analyser l’impact du GAHT sur la santé des personnes TG et ses effets potentiels à long terme. De plus, les personnes TG sont exposées, comme la population générale, à des contaminants chimiques - en particulier, les perturbateurs endocriniens (DE) - qui ciblent le système endocrinien en tant que GAHT, entraînant une surstimulation⁹.

Les DE sont un groupe de produits chimiques affectant les organismes et/ou leur descendance en modifiant différents processus hormonaux et métaboliques, tels que la sécrétion, l’activation, la synthèse, la libération et la liaison d’hormones naturelles. Étant donné que les troubles de l’érection sont répandus dans l’environnement, les aliments et les produits d’usage quotidien (p. ex., bouteilles et contenants en plastique, doublures de boîtes de conserve métalliques, détergents, produits ignifuges, aliments, jouets, cosmétiques et pesticides, etc.), la population générale est exposée en permanence tout au long de la vie¹⁰. De plus, même une exposition à de faibles doses de PE peut entraîner des lésions tissulaires et organiques, et un phénomène courant associé à l’exposition aux DE est l’apparition d’effets spécifiques au sexe chez les animaux de laboratoire et chez les humains¹¹. À titre d’exemple, l’exposition au bisphénol A (BPA), un matériau en contact avec les aliments, est liée à des risques pour la santé tels que l’endométriose et le syndrome des ovaires polykystiques chez les femmes, ainsi qu’à une fertilité réduite, en raison de ses effets œstrogéniques¹². Chez les hommes, le BPA peut abaisser les niveaux et diminuer la qualité du sperme¹³. De plus, les pesticides sont associés à un risque plus élevé de cancer du sein chez les femmes et à des problèmes de fertilité importants chez les hommes¹³. Jusqu’à présent, il n’existe pas d’outils spécifiques pour étudier les effets toxicologiques des contaminants environnementaux, y compris les PE, chez les personnes TG⁹.

La présente étude vise à décrire les méthodes et les paramètres retenus pour le développement de deux modèles animaux de TG : un modèle démasculinisant-féminisant (dMF) et un modèle déféminisant-masculinisant (dFM). En particulier, le choix des doses appropriées, du moment et du mode d’administration des hormones sur la base des thérapies humaines actuelles est évalué¹⁴. De plus, les biomarqueurs tissulaires et fonctionnels qui définissent les modèles de manière unique sont identifiés et caractérisés. En outre, l’efficacité et la tolérabilité du traitement chez l’animal ainsi que la sélection des marqueurs les plus appropriés pour une utilisation dans des études à long terme sont décrites en détail, ainsi que les techniques utilisées à ces fins.

Afin de caractériser les modèles, les critères d’évaluation suivants sont analysés : taux sérique de testostérone (T) (le meilleur biomarqueur pour évaluer le succès de la GAHT dans les deux modèles ^9,15) ; taux sérique d’œstradiol (E2) (les deux modèles) ; l’hormone stimulant la thyroïde (TSH) et la thyroxine (T4) (modèle dMF) ; numération des spermatozoïdes (modèle dMF) ; dimension clitoridienne (modèle dFM) ; Analyse histopathologique des organes reproducteurs, du foie et de la thyroïde (pour les deux modèles). De plus, l’expression génique des isoformes du cytochrome P450 hépatique spécifiques au sexe suivantes (CYP450s, pour les deux modèles) est également analysée^16,17 : CYP2C11 (spécifiquement exprimée dans le foie masculin), CYP3A18 (exprimée 25 fois plus dans le foie masculin que dans le foie féminin), CYP2C12 (spécifiquement exprimée dans le foie féminin) et CYP2C6 (principalement exprimée dans le foie féminin, mais présente à des niveaux inférieurs, également chez le mâle).

Protocole

Les études sont réalisées conformément à la directive 2010/63/UE, au décret législatif italien n° 26 du 4 mars 2014 et aux principes de bonnes pratiques de laboratoire (BPL) de l’OCDE. Le protocole de l’étude a été approuvé par le ministère italien de la Santé (autorisation n° 806/2021-PR). Ici, 16 jeunes rats Sprague-Dawley sexuellement matures des deux sexes (304 rats mâles ± 13 g et 190 rats femelles ± 7 g, âgés de 8 à 9 semaines) sont achetés et logés dans deux par cage dans des conditions de laboratoire standard (22 ± 0,5 °C, 50 % à 60 % d’humidité relative, 12 h d’alternance sombre-lumière avec 12 à 14 changements d’air par heure) avec de l’eau et de la nourriture disponibles à volonté. Dans toutes les cages, pour l’enrichissement environnemental de chaque animal, insérez des blocs de bois et remplacez-les chaque semaine.

REMARQUE : Les animaux âgés de 8 à 9 semaines ont été choisis car la GAHT peut commencer à l’adolescence (stades Tanner 2 à 3), correspondant à 8-9 semaines chez les rongeurs, et elle dure longtemps, potentiellement toute la vie des personnes TG⁹.

1. Dimensionnement des groupes et soins aux animaux

1. Utiliser les jeunes rats adultes mâles et femelles Sprague-Dawley (âgés de 8 à 9 semaines) comme modèle, car le rat est l’espèce préférée indiquée par l’OCDE (p. ex., la ligne directrice 421 Essai de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement) et la seule espèce de rongeur proposée et prise en compte dans la ligne directrice 407 de l’OCDE (étude de toxicité par voie orale de 28 jours à dose répétée chez les rongeurs, mise à jour avec les paramètres de détection des EI).
2. Utilisez le logiciel G*Power pour le dimensionnement du groupe. Pour les modèles dFM et dMF, sélectionnez quatre groupes d’essai : un groupe témoin (C) et trois groupes d’animaux traités avec différentes doses de GAHT. Effectuez le dimensionnement en référence à la comparaison entre deux groupes (dose de traitement par rapport à C) avec le test de Mann-Whitney, un niveau de signification bilatéral alpha = 0,0167 (correspondant à alpha = 0,05 avec la correction de Bonferroni appliquée aux 3 comparaisons entre chaque dose de traitement et le C), et une puissance 1-bêta = 0,80.
   1. Le nombre calculé de rats/groupes est le suivant :
      pour le modèle dFM, animaux/groupe n=4, selon Kinnear et ^al.18 indiquant après 2 semaines de traitement, les niveaux suivants : dans le groupe témoin : 0,2 ± 0,3 ng/mL, dans le groupe hormonothérapie : 16 ± 5 ng/mL (moyenne ± écart-type), correspondant à une dimension d’effet mesurée avec le d = 4,46 de Cohen (effet très important).
      pour le modèle dMF : animaux/groupe n=3, selon Gómez et ^al.19 indiquant après 2 semaines de traitement, les niveaux suivants : groupe témoin : 1,901 ± 0,413 ng/mL et groupe d’hormonothérapie : 0,043 ± 0,023 ng/mL (erreur type moyenne ±) correspondant à une dimension d’effet mesurée avec d = 6,35 de Cohen (effet très important).
   2. Pour aligner les deux modèles, choisissez n=4 animaux par sexe/groupe, pour un total de N = 32 animaux.
3. Après 1 semaine d’acclimatation, répartir les rats par sexe en deux groupes expérimentaux (dMF et dFM, 4 rats/groupe), chacun composé d’un C (mâle témoin, CM et femelle témoin, CF) et de trois groupes de traitement du GAHT sélectionné.
4. Surveillez tous les rats 2 fois par jour (à 8 h 30 et à 16 h) pour vérifier l’état de santé général et l’agressivité potentielle due à l’administration de GAHT. Enregistrez le poids corporel (p.c.) et la consommation d’aliments 2 fois par semaine, à l’aide d’une balance analytique avec la fonction de pondération dynamique optimale pour le poids des animaux de laboratoire.
5. Dans le modèle expérimental dFM, mesurer le diamètre clitoridien de tous les rats immédiatement avant le début du traitement (point 0) et à la fin du traitement (point 13), à l’aide d’une jauge numérique pour des lectures de précision.
6. Pesez tous les animaux avant le sacrifice et, dans le modèle dMF, retirez immédiatement après le sacrifice l’épididyme afin d’effectuer le comptage des spermatozoïdes.

2. Sélection et préparation de la dose

1. Utilisez les trois doses d’hormones suivantes à administrer aux rats dFM : 5, 10,5 et 22,5 mg/kg par semaine, pour le modèle dMF, utilisez les trois niveaux de dose sélectionnés (DL) suivants : DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg et DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
   REMARQUE : Toutes les doses sont sélectionnées en tenant compte des principales directives cliniques humaines utilisées pour les personnes TG¹⁵ et des données limitées disponibles dans la littérature.
2. Préparez toutes les solutions mères chaque semaine à l’aide d’une hotte de sécurité chimique. Mélangez correctement toutes les substances dans l’huile de sésame en tant que véhicule, en assurant leur solubilisation complète.
   REMARQUE : Pour les deux modèles, utilisez un calculateur de conversion de dose (https://dosecal.cftri.res.in/) pour entrer la dose à convertir, l’espèce pour laquelle la dose a été réglée, l’espèce animale et le poids pour lequel convertir la dose. Pour le modèle dFM (Tableau 3), hormonothérapie humaine, une dose maximale de 100 mg de T par semaine²⁰. La dose calculée chez le rat est de 10,5 mg/kg de T par semaine. La deuxième dose est de 22,5 mg/kg par semaine chez le rat¹⁸. La troisième dose est de 5 mg/kg par semaine, identifiée en maintenant le facteur de 2,1 entre les deux doses calculées. Pour le modèle dMF, voir le tableau 4, les doses sont basées sur les schémas thérapeutiques recommandés pour les humains²¹ et les données disponibles dans le cadre d’études in vivo 14,19,22.

3. Traitement des animaux

1. Effectuez l’administration sous-cutanée de T (pour le modèle dFM) et E2 plus CPA (pour le modèle dMF) en pinçant et soulevant la peau au site d’injection, formant une sorte de rideau. Ensuite, insérez l’aiguille d’une seringue de 1 mL parallèlement au dos de l’animal. Une fois à l’intérieur, injectez lentement le volume requis (100 μL pour T ; 200 μL pour E2+CPA)²³.
   1. Traiter les animaux de la façon suivante : pour le modèle dFM, administrer le T énanthate dissous dans l’huile de sésame (véhicule) 2 fois/semaine pendant 2 semaines (100 μL pour chaque injection sous-cutanée de T). Pour le modèle dMF, administrer E2 plus l’acétate de CPA dissous dans de l’huile de sésame (véhicule) 5 fois/semaine pendant 2 semaines (200 μL pour chaque injection sous-cutanée). Traitez les rats du groupe C de la même manière avec le véhicule uniquement (huile de sésame).

4. Prélèvement sanguin, sacrifice et prélèvement de tissus

1. Après 2 semaines de traitement, juste avant le sacrifice, utilisez un système d’anesthésie gazeuse et anesthésez tous les animaux. Induire l’anesthésie par une dose variant de 2 % à 3,5 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1,5 L/min jusqu’à la perte des réflexes dans une chambre d’induction en polystyrène transparent. Placez le rat en position couchée sur le coussin chauffant et régulez la dose d’isoflurane à une dose d’entretien variant de 1,5 % à 3,5 % administrée par un masque nasal standard pour rats tout au long de la procédure de prélèvement sanguin intracardiaque.
2. Préparez une seringue de 5 mL avec une aiguille de 21G, en éliminant le vide. En sondant le cœur avec les doigts, insérez soigneusement l’aiguille dans la paroi thoracique latérale perpendiculairement au corps à peu près au point des coudes fléchis, entre les côtes 5 et 6. Une fois à l’intérieur du ventricule cardiaque, le sang pénètre dans la seringue par capillarité. Rétractez le piston de la seringue lentement et continuellement jusqu’à ce que le sang prélève.
3. Après le prélèvement sanguin, placez les rats dans la chambre de CO₂ afin d’effectuer l’euthanasie par asphyxie au CO₂ avec un taux de remplissage de 30 % à 70 % de déplacement du volume de la chambre par minute. Après 2-3 min, vérifiez la mort des animaux en surveillant la respiration et le rythme cardiaque²⁴.
4. Après le sacrifice, placez chaque animal sur la table de dissection en position couchée, les pattes avant vers le haut et les pattes arrière vers le bas, et fixez-les avec des épingles. Saupoudrez l’abdomen de l’animal d’une solution désinfectante.
5. Exciser les organes suivants : testicules, épididyme, utérus, ovaires, foie et thyroïde. Pesez-les et conservez-les dans des tubes de 50 ml avec 35 ml de formol tamponné à 10 % (tous les organes) ou de solution de Bouin (testicules uniquement) ou collectez-les dans des tubes cryogéniques (un organe/tube) et congelez-les immédiatement dans de l’azote liquide (pour un stockage à -80 °C).
   1. Tout d’abord, coupez la peau avec des ciseaux sur la ligne médiane, du pubis au haut de l’abdomen. Faites deux coupes latérales sur la cage thoracique et réfléchissez la peau des deux côtés de l’incision pour exposer les viscères thoraciques.
   2. Retirez d’abord les organes reproducteurs ; Chez les rats mâles, retirer les testicules, organes appariés de forme ovale situés dans la cavité abdominale, en position intra-abdominale (sac scrotal). Coupez et appuyez sur le sac scrotal pour vous assurer que les testicules dépassent, puis saisissez-les doucement. Tenez la graisse viscérale avec une pince, puis coupez les testicules loin des viscères. Après l’excision, pesez et conservez les testicules dans la solution de Bouin pour une analyse histopathologique.
   3. Chez les rats femelles, saisissez d’abord délicatement l’utérus, puis coupez les ovaires (qui sont situés à l’extrémité des deux cornes utérines) du tissu adipeux viscéral. Après l’excision, pesez les ovaires.
   4. Chez les rats femelles et mâles, passez du côté droit de la cavité abdominale, où se trouve le foie. Le foie est un organe multilobulé et il est possible d’identifier de nombreuses parties : médiale gauche (plus petite), latérale gauche (majeure), médiale droite (plus petite), latérale droite (majeure), caudée et lobe carré²⁵. Saisissez le foie avec une pince en prenant soin de ne pas le casser. Saisissez le processus xiphoïde avec une pince et coupez complètement le diaphragme avec des ciseaux.
   5. Utilisez des pinces pour soulever le processus xiphoïde et extraire le foie de la cavité abdominale. Séparez le foie du diaphragme avec des ciseaux. Après cela, pesez le foie et stockez-le.
   6. Pour l’extraction de la thyroïde, à l’aide de ciseaux, coupez perpendiculairement le long du cou de l’animal, retirez la peau et la musculature et coupez doucement les extrémités de la trachée, dans laquelle se trouve la glande thyroïde. Conservez la thyroïde pour une analyse plus approfondie²⁶.
6. Effectuez le comptage des spermatozoïdes comme décrit ci-dessous.
   1. Après l’ablation des testicules, saisissez l’épididyme, qui est attaché au bord postérieur du testicule respectif et contenu dans le scrotum.
   2. Dans cette expérience, des échantillons de sperme sont prélevés sur la queue de l’épididyme droit. Au moment du prélèvement, nettoyez la queue de la graisse et du tissu conjonctif à l’aide de ciseaux, séparez-la de la partie restante et placez-la dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) contenant 1 ml de DMEM. Couper aux ciseaux et couler à l’aide d’une pipette Pasteur pour faciliter la libération du contenu.
   3. Transférez tout le liquide obtenu dans un tube de 15 mL et portez le volume à 10 mL avec du DMEM (facteur de dilution 1:10=0,1). Pipeter le contenu pour homogénéiser et créer une suspension. Après une légère secousse, prélever 10 μL de suspension pour charger la chambre Neubauer. Chargez l’appareil photo et après 3 minutes de chargement de l’appareil photo, lancez le comptage.

5. Test immuno-enzymatique (ELISA)

1. Prélever des échantillons de sang (environ 2 à 5 mL par animal) dans des tubes de 2 mL et les laisser coaguler à température ambiante pendant 1 h. Faites tourner tous les échantillons de sang dans une centrifugeuse 2x pendant 15 min à 4 °C et 3000 x g.
2. Le sang centrifugé a un aspect multicouche avec trois couches de couleurs différentes. La couche supérieure est constituée de plasma (généralement jaune ou transparent), la partie liquide du sang ; la couche sous le plasma peut avoir une coloration blanchâtre ou grise et est la couche leucocytaire. La couche inférieure contient des globules rouges et la couleur peut apparaître rouge foncé ou rouge vif. Pour déterminer les taux d’hormones sexuelles, prélevez le sérum de tous les échantillons à l’aide d’une pipette (sans toucher la couche leucocytaire ou les couches érythrocytaires), divisez-les en aliquotes (500 μL) et conservez-les à -80 °C.
3. Dans les deux modèles, effectuer un test ELISA pour détecter et/ou mesurer la présence de protéines, d’anticorps ou d’antigènes dans l’échantillon pour la détermination des hormones sexuelles. Utilisez la méthode directe et suivez les instructions de chaque kit ELISA. Dans cette étude, les taux sériques des hormones suivantes ont été déterminés chez le rat : E2, estradiol de rat ELISA ; T, souris/rat Testostérone Elisa ; TSH, Rat ELISA Kit et T4, Rat ELISA Kit.

6. Analyse histopathologique

1. Préparer des lames histologiques de tissus selon les procédures suivantes.
2. Fixez les échantillons de l’utérus, de l’ovaire, de la thyroïde et du foie au moment de l’extraction dans du formol tamponné à 10 % pendant au moins 48 h.
   ATTENTION : Travailler sous une cagoule chimique. N’inhalez pas la substance/le mélange. Évitez de générer des vapeurs/aérosols.
3. Laver les échantillons à l’eau courante pendant 1 h, puis les stocker dans de l’alcool éthylique à 80 % (C₂H₅OH) jusqu’au traitement, afin de préserver la structure protoplasmique des altérations résultant de la mort cellulaire.
4. Fixez les testicules dans la solution de Bouin composée de 15 mL de solution saturée d’acide picrique, 5 mL de formol concentré (33 % à 40 %) et 1 mL d’acide acétique glacial pendant 48 h. Laver les échantillons avec de l’alcool éthylique à 80 %.
   ATTENTION : Travailler sous une cagoule chimique.
5. Effectuez l’inclusion dans de la paraffine solide à l’aide d’un processeur de tissu automatique. À la fin du processus d’inclusion, placez les échantillons dans de petits récipients métalliques dans lesquels de la paraffine fondue a été versée et refroidissez sur une plaque congelée, formant les blocs pour la coupe. Orientez-les en fonction de la section de coupe souhaitée.
6. Après cela, coupez les échantillons à l’aide d’un microtome rotatif. Prélevez des coupes de 5 à 6 μm à l’aide de petits pinceaux, étalez-les dans de l’eau à 37 °C pendant quelques secondes et placez-les sur des lames de verre de microscope. Laissez les lames s’égoutter perpendiculairement pendant quelques minutes et séchez-les au four à 36 °C pendant au moins 1 h.
7. Effectuez la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine comme décrit ci-dessous.
   1. Déparaffiniser les lames en les trempant dans un agent nettoyant d’origine terpénique (substitut de xylène) pendant 5 min.
   2. Réhydratez les lames en les trempant dans la série suivante d’éthanol graué. Pour chaque solution, 2 min par trempette : 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 50 % d’éthanol et de l’eau distillée.
      REMARQUE : Il peut s’agir d’un point d’arrêt pour le protocole, et les lames peuvent être laissées à RT dans l’eau pendant plusieurs heures. En option, les lames peuvent également être stockées à 4 °C dans l’eau.
   3. Placez les lames dans l’hématoxyline de Mayer pendant 5 min. Transférez-les immédiatement dans le récipient avec de l’eau du robinet pendant 5 min. Faites couler l’eau du robinet dans le coin arrière du récipient le plus éloigné des sections. Videz périodiquement le récipient jusqu’à ce que la coloration violette dans l’eau ne soit plus présente.
      REMARQUE : Pour éviter que des sections ne se décollent des diapositives, ne faites pas couler de l’eau directement sur les lames.
   4. Placez les lames dans la solution aqueuse d’éosine Y à 1 % pendant 2 min. Transférez les lames dans de l’eau distillée pendant 15 s. Déshydratez les lames en les trempant dans la série suivante d’éthanol graué. Pour chaque solution, 15 s par trempette : 50 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 95 % d’éthanol.
   5. Placez les lames dans 100 % d’éthanol pendant 1 minute et changez-les en 100 % d’éthanol frais pendant 1 minute supplémentaire. Placez les lames dans un agent nettoyant d’origine terpénique (substitut de xylène) pendant 2 min et changez-le en un agent nettoyant frais d’origine terpénique (substitut de xylène) pendant encore 2 min. Retirez une lame à la fois et placez une lamelle.
   6. Couvrez les sections avec un support de montage et placez une lamelle au bas de la diapositive.
      REMARQUE : Assurez-vous que le support de montage tire la glissière en position. Si la lamelle n’est pas plate, tapotez-la doucement pour la mettre en place. Épongez tout excès de support de montage à l’aide d’une serviette en papier.
   7. Trempez une lingette nettoyante dans l’agent nettoyant d’origine terpénique (substitut de xylène) et essuyez le dos de la lame pour éliminer tout milieu égoutté. Placez la diapositive à plat sur une surface solide mobile, comme un morceau de carton. Ajoutez une lamelle à toutes les lames restantes comme décrit à l’étape 6.7.6. Laissez les glissières sécher et le support de montage durcir à RT dans la hotte.
      ATTENTION : Travailler sous une cagoule chimique.
8. Après la coloration, recouvrez les échantillons d’une lamelle et évaluez-les à l’aide d’un microscope optique. Des changements histopathologiques ont été décrits en fonction de la distribution, de la gravité et des caractéristiques morphologiques.
9. Évaluer les blessures de manière semi-quantitative, à l’aide d’une échelle d’évaluation de 5 points (de 0 à 4), en tenant compte de la gravité des changements en fonction de critères expliqués par Shackelford et ^coll.27 et résumés comme suit :
   Grade 0 : aucun changement
   Grade 1 : changement minimum. L’effet est à peine visible sur les tissus ; petit et peu fréquent. Affecte une partie du tissu inférieure ou égale à 10 %.
   Grade 2 : changement de lumière. Représente un petit changement histologique. Ce grade est utilisé lorsque le tissu, ou sa structure, a montré un changement de volume entre 11 % et 20 %.
   Grade 3 : changement modéré. Le changement est évident dans les tissus. Le degré indique la présence de variations entre 21 % et 40 % du tissu ou de sa structure
   Grade 4 : changement marqué. Changement histologique écrasant du tissu ou de sa structure. Les variations affectent 41 % à 100 % des tissus.
10. Effectuer une analyse histomorphométrique quantitative sur l’utérus, l’ovaire, le testicule et la thyroïde. Examinez des coupes de tissus à l’aide d’un système d’analyse d’images appliqué à un microscope optique et suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Utérus : À l’aide d’un objectif 2x, mesurez la surface totale de chaque section transversale de la corne utérine droite, du myomètre externe et interne et de la lumière utérine. Calculez l’aire de l’endomètre et du myomètre et le rapport entre l’aire de l’endomètre et le myomètre²⁸.
    2. Ovaire : Utilisez l’une des sections entières en position centrale de l’ovaire pour révéler les follicules à différents stades de développement ; compter les follicules primaires, secondaires, du corps jaune, de Graaf et atrésiques à l’aide d’un objectif 4x. Effectuer la classification des follicules selon Fortune²⁹. De plus, mesurez l’aire de l’ovaire pour chaque échantillon et sa densité folliculaire (nombre de follicules/surface de l’ovaire x 100)³⁰.
    3. Testicule : À l’aide de l’objectif 10x, mesurez 20 tubules/échantillon ; De plus, mesurez la surface lumineuse totale, la surface totale, le diamètre longitudinal et le diamètre transversal²⁸.
    4. Thyroïde : Mesurer les paramètres suivants : densité folliculaire (rapport entre le nombre de follicules et une zone donnée, objectif 10x) ; hauteur indirecte des cellules folliculaires (rapport moyen de la surface folliculaire et de la surface colloïdale dans cinq follicules choisis au hasard/échantillon objectif 40x) ; le rapport moyen entre les surfaces de l’épithélium folliculaire et le nombre de noyaux (dans le même follicule pour déterminer la maturation folliculaire) ; Hauteur des cellules folliculaires (moyenne de cinq cellules dans cinq follicules/échantillon choisis au hasard, 64x objectif)³¹.

7. Expression des gènes

1. Pour les deux modèles, effectuez l’analyse de l’expression génique à l’aide d’échantillons de foie conservés à -80 °C. Suivez le protocole de purification totale de l’ARN à l’aide d’un kit, à partir d’un lysat de tissu animal.
   1. Pour obtenir le lysat hépatique, broyez l’échantillon de tissu (10 mg) avec un minipinner, ajoutez 600 μL de RL BUFFER (fourni avec le kit) à l’échantillon de tissu et continuez à broyer jusqu’à ce que l’échantillon soit homogénéisé.
2. Immédiatement après l’extraction, quantifier l’ARN obtenu et évaluer sa qualité (pour la dénaturation ou la présence d’éventuels résidus protéiques) à l’aide d’un fluorospectromètre. Effectuez des lectures d’absorbance spectrophotométriques aux longueurs d’onde de 260 nm et 280 nm, où les acides nucléiques et les protéines absorbent respectivement.
3. Après l’évaluation de la concentration totale d’ARN, à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc suivant les instructions du fabricant, transcrire à l’envers le volume approprié contenant 1 μg d’ARN total de chaque échantillon en ADNc.
4. Analysez l’ADNc obtenu par RT-PCR.
   1. Pour analyser l’expression génique des gènes d’intérêt, des amorces directes et inverses spécifiques ont été conçues pour chaque gène cible, ainsi que pour le gène de référence glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase exprimé constitutivement (GAPDH). Utilisez l’application web Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) pour choisir les meilleures amorces qui garantiraient la spécificité de l’appariement uniquement au gène d’intérêt et obtenir les oligonucléotides synthétisés par un fournisseur commercial. Les séquences des paires d’amorces utilisées sont présentées dans le tableau 5.
   2. Remettre en suspension les amorces lyophilisées avec de l’eau distillée exempte de RNAse à une concentration finale de 100 mM. Utilisez un kit dédié pour effectuer une analyse qPCR. Réaliser les réactions dans un volume final de 20 μL, en diluant l’ADNc recuit 1:40. Chargez chaque échantillon en double dans des plaques de PCR à 96 puits.
   3. Effectuez des cycles qPCR sur thermocycleur en suivant ce programme : 1 cycle à 95 °C pendant 10 min ; 40 cycles à 95 °C pendant 15 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min. A la fin, effectuez un cycle de dissociation de 55°C à 95°C (30 s/°C) pour vérifier la spécificité du produit amplifié. À l’aide du logiciel dédié de la machine, obtenez des valeurs de cycle de seuil (Seuil de Cycle, Ct) pour chaque échantillon. Exprimer les résultats sous la forme ΔΔ Ct (delta delta Ct) selon la formule de Pfaffl³² :
      Gène cible ΔCt = Contrôle Ct - Traité par Ct
      Gène de référence ΔCt = Contrôle Ct - Traité par Ct
      ΔCt = ΔCt Gène cible - ΔCt Gène de référence

8. Analyse des données

1. Effectuez la gestion des données à l’aide d’un tableur. Effectuer des analyses à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Concevez des graphiques à l’aide d’un logiciel spécifique.
2. Représentent le gain de poids corporel, la consommation alimentaire, le poids absolu et relatif des organes, les taux sériques d’hormones, les données morphométriques tissulaires et les données d’expression génique sous forme de moyenne ± d’écart-type. Effectuer une analyse de Kruskal-Wallis non paramétrique, suivie de comparaisons par paires a posteriori (test de Mann-Whitney).
3. Analysez les données histologiques à l’aide d’un test exact de Fisher à 2 voies pour identifier les différences significatives par rapport au groupe témoin, y compris les échantillons qui sont attribués à une catégorie sans aucune référence aux gradations de gravité (incidence totale des résultats). Utilisez le test de tendance de Cochran-Armitage pour identifier la tendance dose-réponse. Considérez les différences entre les groupes comme significatives si la valeur p est < 0,05.

Résultats

Comme l’ont démontré Tassinari et ^al.14 et Tammaro et ^al.33, les résultats suivants ont montré le succès de la GAHT sur les rats et la pertinence des modèles.

Aucune mortalité ou comportement anormal, tel que l’agressivité, n’est enregistré, et aucun signe clinique de toxicité ou de souffrance (par exemple, diminution de l’activité, piloérection et apparence non soignée) n’est observé

Discussion

La mise en œuvre de modèles de rongeurs imitant la GAHT est cruciale pour étudier la susceptibilité et la vulnérabilité spécifiques potentielles des personnes TG et les résultats à long terme des thérapies, qui durent généralement toute leur vie.

Étant donné le faible nombre d’études similaires dans la littérature, le point critique de cette expérience est la sélection des doses pour établir les modèles ; Ces doses doivent être suffisamm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical balance ABJ 320-4NM	Kern	Z741091
Bouin	Biooptica	05-M01008
Centrifuge 5415 R	Eppendorf		For eppendorf
Cyproterone Acetate	Sigma-Aldrich	C3412
D-MEM medium	Gibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXN	Smobio	TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for Windows	GraphPad Software
Hematoxylin	Biooptica	05-06002/L
Heosin	Biooptica	05-10007/L
Imaging Software	Nikon		NIS-BR
JMP 10 statistical software	SAS Institute
Microm	Thermo Scientific	HM 325
Microscopy	Nikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISA	Biovendor	RTC001R	96T
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		ND-1000
Paraffina	Biooptica	087910
Portable Balances SCOUT STX2202	OHAUS	30253064
Primers	Life Technologies		Designed by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISA	Biovendor	RTC009R	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
SensiFASTcDNA Synthesis Kit	Bioline	BIO-65053	50 reaction
Sesam Oil	ACROS	AC241000010
Sprague Dawley rats male and female	Envigo		8/9 weeks old
Standard diets	Mucedola	4RF18
T4(Thyroxine) ELISA Kit	ELK Biotechnology	ELK8716	96T
Testosterone enanthate	Sigma-Aldrich	T3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus Bioer	Aurogene
Tissue processor	Shandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KIT	Norgen	17200	50 column
Victor 3 Multilabel reader	Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerate	Sigma-Aldrich	E1631