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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei Nagetiermodellen, die geschlechtsbejahende Hormontherapien durch subkutane Verabreichung von Testosteron oder Östradiol plus Cyproteronacetat (wird in Humantherapien für Transgender-Menschen verwendet) nachahmen: Festlegung der Dosen, Identifizierung relevanter Biomarker und Bewertung der Wirkungen.

Zusammenfassung

Transgender-Personen (TG) sind Personen, deren Geschlechtsidentität und Geschlecht, das bei der Geburt zugewiesen wurde, nicht übereinstimmen. Sie unterziehen sich häufig einer geschlechtsbejahenden Hormontherapie (GAHT), einem medizinischen Eingriff, der den Erwerb sekundärer Geschlechtsmerkmale ermöglicht, die besser auf ihre individuelle Geschlechtsidentität abgestimmt sind, und konsistente Ergebnisse bei der Verbesserung zahlreicher sozialpsychologischer Variablen liefert. GAHT zielt jedoch auf verschiedene Körpersysteme ab, und einige Nebenwirkungen sind aufgezeichnet, wenn auch noch nicht vollständig identifiziert und charakterisiert. Daher können TG-Patienten, die sich einer GAHT unterziehen, als empfängliche Untergruppe der Bevölkerung angesehen werden, und im Rahmen der Risikobewertung sollte besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, z. B. durch die Verwendung gezielter Tiermodelle. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verfahren zur Implementierung von zwei Rattenmodellen, die GAHT nachahmen: das demaskulinisierende-feminisierende Modell (dMF), das das GAHT für TG-Frauen nachahmt, und das defeminisierend-maskulinisierende Modell (dFM), das das GAHT für TG-Männer nachahmt. Die Modelle wurden durch die Verabreichung der gleichen Hormone implementiert, die für die menschliche GAHT verwendet werden, nämlich β-Estradiol plus Cyproteronacetat für dMF und Testosteron für dFM, auf den gleichen Expositionswegen für einen Zeitraum von 2 Wochen. Die Ratten werden während der Behandlung täglich untersucht, um den Gesundheitszustand und potenziell aggressives Verhalten zu beurteilen. Bei der Tötung wurden Blutproben und Zielgewebe entnommen und für biochemische, molekulare und histopathologische Analysen gelagert. Geschlechtsspezifische Parameter, nämlich die Spermienzahl und die Klitorisabmessungen, wurden ebenfalls ausgewertet. Darüber hinaus werden CYP450-Isoformen, die ausschließlich und/oder bevorzugt in männlicher und weiblicher Rattenleber exprimiert werden, als neuartige Biomarker identifiziert und charakterisiert, um den Erfolg von GAHT zu verifizieren und das Modell festzulegen. Die Beteiligung der Schilddrüse wurde auch als ein wichtiges Ziel im endokrinen System untersucht.

Einleitung

Die psychologische Wahrnehmung des Individuums, männlich, weiblich, keines von beiden, beides oderirgendwo dazwischen zu sein, wird als Geschlechtsidentität bezeichnet. Es kann dem biologischen Geschlecht entsprechen (cisgender) oder unterschiedlich sein (transgender - TG). Ein TG-Mann ist ein Individuum, das als Frau geboren wurde, sich aber als Mann identifiziert. Eine TG-Frau wird als Mann geboren, identifiziert sich aber als Frau2. Es wird geschätzt, dass es derzeit weltweit 25 Millionen TG-Menschengibt 3, von denen die meisten an Geschlechtsdysphorie leiden, einer psychischen Erkrankung, die durch eine Inkongruenz zwischen ihrem Geschlecht und demjenigen, das ihnen bei der Geburt zugewiesen wurde,gekennzeichnet ist 4 und die zu sozialer Diskriminierung und Schwierigkeiten am Arbeitsplatz und in der Familie führen kann, was oft zu Depressionen führt. Angst und Stress5. Aus diesen Gründen unterziehen sich TG-Menschen häufig einer geschlechtsangleichenden Hormontherapie (GAHT) und/oder einer geschlechtsangleichenden Operation. GAHT ist bei TG-Männern durch die Verabreichung von Testosteron (T) (Tabelle 1) und bei TG-Frauen durch Östrogene (E2) plus Antiandrogene (Tabelle 2) gekennzeichnet6.

GAHT hält in der Regel ein Leben lang an und wirkt kontinuierlich auf das endokrine System 7,8. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen des GAHT auf die Gesundheit von TG-Menschen und seine potenziellen langfristigen Auswirkungen zu analysieren. Darüber hinaus sind TG-Menschen, wie die Allgemeinbevölkerung, chemischen Schadstoffen ausgesetzt - insbesondere den endokrinen Disruptoren (ED) -, die auf das endokrine System wie die GAHT abzielen, was zu einer Überstimulation führt9.

ED sind eine Gruppe von Chemikalien, die den Organismus und/oder seine Nachkommen beeinflussen, indem sie verschiedene hormonelle und metabolische Prozesse verändern, wie z. B. die Sekretion, Aktivierung, Synthese, Freisetzung und Bindung natürlicher Hormone. Da ED in der Umwelt, in Lebensmitteln und Produkten des täglichen Gebrauchs (z. B. Plastikflaschen und -behälter, Auskleidungen von Lebensmitteldosen aus Metall, Waschmittel, Flammschutzmittel, Lebensmittel, Spielzeug, Kosmetika und Pestizide usw.) weit verbreitet sind, ist die Allgemeinbevölkerung während des gesamten Lebens kontinuierlich exponiert10. Darüber hinaus kann selbst eine niedrig dosierte Exposition gegenüber EDs zu Gewebe- und Organschäden führen, und ein häufiges Phänomen im Zusammenhang mit ED-Exposition ist das Auftreten geschlechtsspezifischer Wirkungen sowohl bei Labortieren als auch beim Menschen11. So ist beispielsweise die Exposition gegenüber dem Lebensmittelkontaktmaterial Bisphenol A (BPA) aufgrund seiner östrogenen Wirkung mit Gesundheitsrisiken wie Endometriose und polyzystischem Ovarialsyndrom bei Frauen sowie mit einer verminderten Fruchtbarkeit verbunden12. Bei Männern kann BPA den Spiegel senken und die Spermienqualität verringern13. Darüber hinaus werden Pestizide mit einem höheren Brustkrebsrisiko bei Frauen und erheblichen Fruchtbarkeitsproblemen bei Männern in Verbindung gebracht13. Bisher stehen keine spezifischen Instrumente zur Verfügung, um die toxikologischen Auswirkungen von Umweltkontaminanten, einschließlich ED, bei TG-Menschenzu untersuchen 9.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Methoden und Parameter zu beschreiben, die für die Entwicklung von zwei TG-Tiermodellen ausgewählt wurden: einem demaskulinisierend-feminisierenden Modell (dMF) und einem defemininiszierend-maskulinisierenden Modell (dFM). Insbesondere werden die Auswahl geeigneter Dosierungen, der Zeitpunkt und die Art der Verabreichung der Hormone auf der Grundlage der aktuellen Humantherapien bewertet14. Darüber hinaus werden Gewebe- und funktionelle Biomarker, die die Modelle eindeutig definieren, identifiziert und charakterisiert. Darüber hinaus werden die Wirksamkeit und Verträglichkeit der Therapie bei Tieren sowie die Auswahl der am besten geeigneten Marker für den Einsatz in Langzeitstudien zusammen mit den dafür verwendeten Techniken ausführlich beschrieben.

Um die Modelle zu charakterisieren, werden die folgenden Endpunkte analysiert: Testosteron (T)-Serumspiegel (der beste Biomarker zur Bewertung des Erfolgs von GAHT in beiden Modellen 9,15); Östradiol (E2)-Serumspiegel (beide Modelle); Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) und Thyroxin (T4) (dMF-Modell); Spermienzahl (dMF-Modell); Dimension der Klitoris (dFM-Modell); histopathologische Analyse der Fortpflanzungsorgane, der Leber und der Schilddrüse (für beide Modelle). Darüber hinaus wird auch die Genexpression der folgenden geschlechtsspezifischen Leber-Cytochrom-P450-Isoformen (CYP450s, für beide Modelle) analysiert16,17: CYP2C11 (spezifisch in der männlichen Leber exprimiert), CYP3A18 (in der männlichen Leber 25-mal häufiger exprimiert als in der weiblichen), CYP2C12 (spezifisch in der weiblichen Leber exprimiert) und CYP2C6 (überwiegend in der weiblichen Leber exprimiert, aber in niedrigeren Konzentrationen vorhanden, auch beim Männchen).

Protokoll

Die Studien werden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU, dem italienischen Gesetzesdekret Nr. 26 vom 4. März 2014 und den OECD-Grundsätzen der Guten Laborpraxis (GLP) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt (Zulassungsnummer 806/2021-PR). Hier werden 16 junge geschlechtsreife Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts (304 ± 13 g männliche Ratten und 190 ± 7 g weibliche Ratten, 8-9 Wochen alt) gekauft und unter Standard-Laborbedingungen (22 ± 0,5 °C, 50%-60% relative Luftfeuchte, 12 h Dunkel-Licht-Wechsel mit 12-14 Luftwechseln pro Stunde) mit Wasser und Futter ad libitum untergebracht. In alle Käfige sollten zur Bereicherung der Umwelt jedes Tieres Holznageklötze eingesetzt und wöchentlich ausgetauscht werden.

HINWEIS: Die Tiere im Alter von 8-9 Wochen wurden ausgewählt, da die GAHT während der Adoleszenz beginnen kann (Tanner-Stadien 2 bis 3), was 8-9 Wochen bei Nagetieren entspricht, und sie dauert lange an, möglicherweise für das gesamte Leben von TG-Menschen9.

1. Gruppengröße und Tierbetreuung

  1. Verwenden Sie junge erwachsene männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (8-9 Wochen alt) als Modell, da die Ratte die von der OECD angegebene bevorzugte Spezies ist (z. B. Leitlinie 421 Reproduktions-/Entwicklungstoxizitäts-Screening-Test) und die einzige Nagetierart, die in der OECD-Leitlinie 407 vorgeschlagen und berücksichtigt wird (28-tägige orale Toxizitätsstudie bei wiederholter Verabreichung an Nagetieren, aktualisiert mit den Parametern für den Nachweis von EIs).
  2. Verwenden Sie die G*Power-Software für die Gruppendimensionierung. Sowohl für das dFM- als auch für das dMF-Modell wählen Sie vier Testgruppen aus: eine Kontrollgruppe (C) und drei Gruppen von Tieren, die mit unterschiedlichen GAHT-Dosen behandelt wurden. Nehmen Sie die Dimensionierung unter Bezugnahme auf den Vergleich zwischen zwei Gruppen (Behandlungsdosis versus C) mit dem Mann-Whitney-Test vor, einem zweiseitigen Signifikanzniveau alpha = 0,0167 (entsprechend alpha = 0,05 mit Bonferroni-Korrektur, die auf die 3 Vergleiche zwischen jeder Behandlungsdosis und der C angewendet wird) und 1-Beta-Leistung = 0,80.
    1. Die berechnete Anzahl der Ratten/Gruppen stellt sich wie folgt dar:
      für das dFM-Modell, Tiere/Gruppe n=4, nach Kinnear et al.18 , die nach 2-wöchiger Behandlung die folgenden Werte anzeigen: in der Kontrollgruppe: 0,2 ± 0,3 ng/ml, in der Hormontherapiegruppe: 16 ± 5 ng/ml (mittlere ± Standardabweichung), entsprechend einer Wirkungsdimension, gemessen mit Cohens d = 4,46 (sehr großer Effekt).
      für das dMF-Modell: Tiere/Gruppe n=3 nach Gómez et al.19 , die nach 2-wöchiger Behandlung die folgenden Werte anzeigen: Kontrollgruppe: 1,901 ± 0,413 ng/ml und Hormontherapiegruppe: 0,043 ± 0,023 ng/ml (mittlerer ± Standardfehler), entsprechend einer Wirkungsdimension, gemessen mit Cohens d = 6,35 (sehr großer Effekt).
    2. Um die beiden Modelle aufeinander abzustimmen, wählen Sie n=4 Tiere pro Geschlecht/Gruppe, also insgesamt N = 32 Tiere.
  3. Nach 1 Woche Akklimatisierung teilen Sie die Ratten nach Geschlecht in zwei Versuchsgruppen (dMF und dFM, 4 Ratten/Gruppe) auf, die jeweils aus einem C (Kontrollmännchen, CM und Kontrollweibchen, CF) und drei Behandlungsgruppen der ausgewählten GAHT bestehen.
  4. Überwachen Sie alle Ratten 2x täglich (um 8:30 Uhr und 16:00 Uhr), um den allgemeinen Gesundheitszustand und die mögliche Aggressivität aufgrund der GAHT-Verabreichung zu überprüfen. Erfassen Sie 2x pro Woche das Körpergewicht (KG) und den Futterverbrauch mit einer Analysenwaage mit der dynamischen Gewichtungsfunktion, die für das Gewicht der Versuchstiere optimal ist.
  5. Messen Sie im experimentellen dFM-Modell den Klitorisdurchmesser aller Ratten unmittelbar vor Beginn der Behandlung (Punkt 0) und am Ende der Behandlung (Punkt 13) mit einem digitalen Messgerät für Präzisionsmessungen.
  6. Wiegen Sie alle Tiere vor der Tötung und entfernen Sie im dMF-Modell unmittelbar nach der Tötung die Nebenhoden, um die Spermienzählung durchzuführen.

2. Dosisauswahl und Zubereitung

  1. Verwenden Sie die folgenden drei Hormondosen, die dFM-Ratten verabreicht werden: 5, 10,5 und 22,5 mg/kg pro Woche, für das dMF-Modell verwenden Sie die folgenden drei ausgewählten Dosisstufen (DL): DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg und DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
    HINWEIS: Alle Dosen wurden unter Berücksichtigung der wichtigsten klinischen Leitlinien beim Menschen für TG-Patienten15 und der begrenzten in der Literatur verfügbaren Daten ausgewählt.
  2. Bereiten Sie alle Stammlösungen wöchentlich mit einer chemischen Sicherheitshaube vor. Mischen Sie alle Substanzen richtig in das Sesamöl als Vehikel und stellen Sie sicher, dass sie vollständig löslich sind.
    HINWEIS: Verwenden Sie für beide Modelle einen Dosisumrechnungsrechner (https://dosecal.cftri.res.in/), um die umzurechnende Dosis, die Spezies, für die die Dosis festgelegt wurde, die Tierart und das Gewicht, für das die Dosis umgerechnet werden soll, einzugeben. Für das dFM-Modell (Tabelle 3) gilt für die Hormontherapie beim Menschen eine maximale Dosis von 100 mg T pro Woche20. Die bei Ratten berechnete Dosis beträgt 10,5 mg/kg T pro Woche. Die zweite Dosis beträgt 22,5 mg/kg pro Woche bei Ratten18. Die dritte Dosis beträgt 5 mg/kg pro Woche, identifiziert durch Beibehaltung des Faktors 2,1 zwischen den beiden berechneten Dosen. Für das dMF-Modell siehe Tabelle 4, die Dosierungen basieren auf den empfohlenen Schemata für den Menschen21 und Daten aus In-vivo-Studien 14,19,22.

3. Behandlung von Tieren

  1. Führen Sie die subkutane Verabreichung von T (für das dFM-Modell) und E2 plus CPA (für das dMF-Modell) durch, indem Sie die Haut an der Injektionsstelle einklemmen und anheben, wodurch eine Art Vorhang entsteht. Führen Sie dann die Nadel einer 1-ml-Spritze parallel zum Rücken des Tieres ein. Sobald Sie sich im Inneren befinden, injizieren Sie langsam das erforderliche Volumen (100 μl für T; 200 μl für E2+CPA)23.
    1. Behandeln Sie die Tiere wie folgt: Für das dFM-Modell verabreichen Sie 2 Wochen lang 2x pro Woche in Sesamöl gelöstes T-Enantat (Vehikel) (100 μl für jede subkutane Injektion von T). Für das dMF-Modell verabreichen Sie E2 plus in Sesamöl gelöstes CPA-Acetat 5x/Woche für 2 Wochen (200 μl für jede subkutane Injektion). Die Ratten der Gruppe C werden nur mit dem Vehikel (Sesamöl) auf die gleiche Weise behandelt.

4. Blutentnahme, Opferung und Gewebeentnahme

  1. Nach 2 Wochen Behandlung, kurz vor der Tötung, verwenden Sie ein Gasanästhesiesystem und betäuben Sie alle Tiere. Induzieren Sie die Anästhesie mit einer Dosis von 2 % bis 3,5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit von 1,5 l/min bis zum Verlust der Reflexe in einer klaren Induktionskammer aus Polystyrol. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf das Heizkissen und regulieren Sie die Isoflurandosis in einer Erhaltungsdosis von 1,5 % bis 3,5 %, die während des gesamten intrakardialen Blutentnahmeverfahrens mit einer Standard-Rattennasenmaske verabreicht wird.
  2. Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit einer 21-G-Nadel vor und beseitigen Sie das Vakuum. Sondieren Sie das Herz mit den Fingern und führen Sie die Nadel vorsichtig senkrecht zum Körper in die laterale Brustwand ein, etwa an der Stelle der gebeugten Ellbogen, zwischen den Rippen 5 und 6. Sobald sich das Blut in der Herzkammer befindet, gelangt es durch Kapillarität in die Spritze. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam und kontinuierlich zurück, bis Blut abgenommen wird.
  3. Nach der Blutentnahme werden die Ratten in die CO2 -Kammer gesetzt, um eine Euthanasie mittels CO2 -Erstickung mit einer Füllrate von 30 % bis 70 % Verschiebung des Kammervolumens pro Minute durchzuführen. Nach 2-3 Minuten wird der Tod der Tiere durch Überwachung der Atmung und des Herzschlags24 überprüft.
  4. Nach dem Opfer jedes Tier in Rückenlage auf den Seziertisch legen, die Vorderbeine nach oben und die Hinterbeine nach unten, und mit Stecknadeln fixieren. Besprühen Sie den Bauch des Tieres mit einer Desinfektionslösung.
  5. Excise die folgenden Organe: Hoden, Nebenhoden, Gebärmutter, Eierstöcke, Leber und Schilddrüse. Wiegen und lagern Sie sie in 50-ml-Röhrchen mit 35 mL 10 % gepuffertem Formalin (alle Organe) oder Bouin-Lösung (nur Hoden) oder sammeln Sie sie in Kryoröhrchen (ein Organ/Röhrchen) und frieren Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff ein (für die Lagerung bei -80 °C).
    1. Schneiden Sie zunächst die Haut mit einer Schere an der Mittellinie vom Schambein bis zum Oberbauch ein. Machen Sie zwei seitliche Schnitte am Brustkorb und reflektieren Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts, um die thorakalen Eingeweide freizulegen.
    2. Entfernen Sie zuerst die Fortpflanzungsorgane; Bei männlichen Ratten entfernen Sie die Hoden, ovale, paarige Organe, die sich in der Bauchhöhle befinden, in der intraabdominalen Position (Hodensack). Schneide den Hodensack ab und drücke ihn, um sicherzustellen, dass die Hoden herausragen, und greife ihn dann vorsichtig an. Halten Sie das viszerale Fett mit einer Zange fest und schneiden Sie dann die Hoden von den Eingeweiden ab. Nach der Exzision werden die Hoden gewogen und in der Bouin-Lösung für die histopathologische Analyse gelagert.
    3. Bei weiblichen Ratten greifen Sie zuerst vorsichtig nach der Gebärmutter und schneiden dann die Eierstöcke (die sich am Ende beider Gebärmutterhörner befinden) aus dem viszeralen Fettgewebe ab. Wiegen Sie nach der Exzision die Eierstöcke.
    4. Bewegen Sie sich sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Ratten auf die rechte Seite der Bauchhöhle, wo sich die Leber befindet. Die Leber ist ein multilobuliertes Organ und es ist möglich, viele Teile zu identifizieren: links medial (kleiner), links lateral (major), rechts medial (kleiner), rechts lateral (major), caudatus und quadratischer Lappen25. Fassen Sie die Leber mit einer Zange und achten Sie darauf, sie nicht zu zerbrechen. Fassen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Zange und schneiden Sie die Membran mit einer Schere vollständig durch.
    5. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Xiphoid-Prozess anzuheben und die Leber aus der Bauchhöhle zu extrahieren. Trenne die Leber mit einer Schere vom Zwerchfell. Danach die Leber wiegen und lagern.
    6. Schneiden Sie für die Schilddrüsenextraktion mit Hilfe einer Schere senkrecht entlang des Halses des Tieres, entfernen Sie Haut und Muskulatur und schneiden Sie vorsichtig die Enden der Luftröhre ab, in der sich die Schilddrüse befindet. Bewahren Sie die Schilddrüse für weitere Analysenauf 26.
  6. Führen Sie die Spermienzählung wie unten beschrieben durch.
    1. Nach der Hodenentfernung greifst du nach dem Nebenhoden, der am hinteren Rand des jeweiligen Hodens befestigt und im Hodensack enthalten ist.
    2. In diesem Experiment werden Samenproben aus dem Schwanz des rechten Nebenhodens entnommen. Reinigen Sie zum Zeitpunkt der Entnahme den Schwanz mit einer Schere von Fett und Bindegewebe, trennen Sie ihn vom restlichen Teil und legen Sie ihn in eine Petrischale (35 mm x 10 mm) mit 1 ml DMEM. Mit einer Schere schneiden und mit einer Pasteur-Pipette fließen, um die Freisetzung des Inhalts zu erleichtern.
    3. Füllen Sie die gesamte erhaltene Flüssigkeit in ein 15-ml-Röhrchen um und bringen Sie das Volumen mit DMEM (Verdünnungsfaktor 1:10 = 0,1) auf 10 mL. Pipettieren Sie den Inhalt, um ihn zu homogenisieren und eine Suspension zu erzeugen. Nach leichtem Schütteln werden 10 μl der Suspension entnommen, um die Neubauer-Kammer zu beladen. Laden Sie die Kamera und starten Sie nach 3 Minuten des Ladens der Kamera die Zählung.

5. ELISA-Assay (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

  1. Entnehmen Sie Blutproben (ca. 2-5 mL pro Tier) in 2-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur gerinnen. Alle Blutproben in einer Zentrifuge 2x für 15 min bei 4 °C und 3000 x g schleudern.
  2. Zentrifugiertes Blut hat ein mehrschichtiges Aussehen mit drei Schichten unterschiedlicher Farbe. Die oberste Schicht besteht aus Plasma (normalerweise gelb oder transparent), dem flüssigen Teil des Blutes; die Schicht unter dem Plasma kann eine weißliche oder graue Färbung haben und ist das Buffy-Fell. Die unterste Schicht enthält rote Blutkörperchen, und die Farbe kann dunkelrot oder hellrot erscheinen. Um den Sexualhormonspiegel zu bestimmen, entnehmen Sie das Serum aller Proben mit einer Pipette (ohne das Buffy Coat oder die Erythrozytenschichten zu berühren), teilen Sie sie in Aliquots (500 μL) auf und lagern Sie sie bei -80 °C.
  3. In beiden Modellen ist ein ELISA-Test durchzuführen, um das Vorhandensein von Proteinen, Antikörpern oder Antigenen in der Probe zur Bestimmung von Sexualhormonen nachzuweisen und/oder zu messen. Verwenden Sie die direkte Methode und befolgen Sie die Anweisungen jedes ELISA-Kits. In dieser Studie wurden die Serumspiegel der folgenden Hormone bei Ratten bestimmt: E2, Ratten-Östradiol-ELISA; T, Maus/Ratte Testosteron Elisa; TSH, Ratten-ELISA-Kit und T4, Ratten-ELISA-Kit.

6. Histopathologische Analyse

  1. Bereiten Sie histologische Gewebeschnitte gemäß den folgenden Verfahren vor.
  2. Fixieren Sie die Proben der Gebärmutter, des Eierstocks, der Schilddrüse und der Leber zum Zeitpunkt der Extraktion für mindestens 48 Stunden in 10 % gepuffertem Formalin.
    ACHTUNG: Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube. Atmen Sie die Substanz/das Gemisch nicht ein. Vermeiden Sie die Erzeugung von Dämpfen/Aerosolen.
  3. Die Proben werden 1 Stunde lang unter fließendem Wasser gewaschen und dann bis zur Verarbeitung in 80%igem Ethylalkohol (C2H5OH) gelagert, um die protoplasmatische Struktur vor Veränderungen durch den Zelltod zu schützen.
  4. Fixieren Sie den Hoden in einer Bouin-Lösung, die aus 15 ml gesättigter Pikrinsäurelösung, 5 ml konzentriertem Formalin (33%-40%) und 1 ml Eisessig für 48 h besteht. Waschen Sie die Proben mit 80%igem Ethylalkohol.
    ACHTUNG: Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
  5. Führen Sie die Einschluss in festes Paraffin mit einem automatischen Gewebeprozessor durch. Am Ende des Einschlussprozesses werden die Proben in kleine Metallbehälter gegeben, in die geschmolzenes Paraffin gegossen wurde, und auf einer gefrorenen Platte abkühlen lassen, um die Blöcke für den Schnitt zu formen. Richten Sie sie je nach gewünschtem Schnittabschnitt aus.
  6. Schneiden Sie danach die Proben mit einem rotierenden Mikrotom. Sammeln Sie 5-6 μm große Schnitte mit kleinen Bürsten, verteilen Sie sie einige Sekunden lang in 37 °C heißem Wasser und legen Sie sie auf Objektträger. Die Objektträger einige Minuten senkrecht abtropfen lassen und im Backofen bei 36 °C mindestens 1 h trocknen lassen.
  7. Führen Sie die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung wie unten beschrieben durch.
    1. Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie 5 Minuten lang in ein Reinigungsmittel terpenartigen Ursprungs (Xylolersatz) tauchen.
    2. Rehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie durch die folgende Reihe von abgestuftem Ethanol tauchen. Für jede Lösung, 2 min pro Dip: 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 80 % Ethanol, 50 % Ethanol und destilliertes Wasser.
      HINWEIS: Dies kann ein Haltepunkt für das Protokoll sein, und die Objektträger können mehrere Stunden lang bei RT im Wasser belassen werden. Optional können die Objektträger auch bei 4 °C in Wasser gelagert werden.
    3. Legen Sie die Objektträger für 5 min in Mayer's Hämatoxylin. Sofort wieder für 5 Minuten mit Leitungswasser in den Behälter umfüllen. Lassen Sie Leitungswasser in die hintere Ecke des Behälters laufen, die am weitesten von den Abschnitten entfernt ist. Leeren Sie den Behälter regelmäßig, bis die violette Färbung im Wasser nicht mehr vorhanden ist.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich Teile von den Rutschen ablösen, lassen Sie kein Wasser direkt auf die Rutschen laufen.
    4. Legen Sie die Objektträger für 2 Minuten in die wässrige Lösung Eosin Y. Übertragen Sie die Objektträger für 15 s in destilliertes Wasser. Entwässern Sie die Objektträger, indem Sie sie durch die folgende Reihe von sortiertem Ethanol tauchen. Für jede Lösung, 15 s pro Dip: 50 % Ethanol, 80 % Ethanol, 95 % Ethanol.
    5. Legen Sie die Objektträger 1 Minute lang in 100 % Ethanol und wechseln Sie sie für weitere 1 Minute gegen frisches 100 % Ethanol. Legen Sie die Objektträger für 2 min in ein Clearmittel terpenischen Ursprungs (Xylol-Ersatz) und wechseln Sie es für weitere 2 min gegen ein frisches Clearmittel terpen-Ursprungs (Xylol-Ersatz). Entfernen Sie eine Folie nach der anderen und legen Sie ein Deckglas an.
    6. Decken Sie die Abschnitte mit Montagemedium ab und legen Sie ein Deckglas auf die Unterseite der Folie.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Montagemedium die Schiene in Position zieht. Wenn das Deckglas nicht flach ist, klopfen Sie es vorsichtig ein. Tupfen Sie überschüssiges Einbettmedium mit einem Papiertuch ab.
    7. Tauchen Sie ein Reinigungstuch in das Reinigungsmittel Terpenursprung (Xylolersatz) und wischen Sie die Rückseite des Objektträgers ab, um das abgetropfte Medium zu entfernen. Legen Sie die Folie flach auf eine bewegliche feste Oberfläche, z. B. ein Stück Pappe. Fügen Sie allen verbleibenden Objektträgern ein Deckglas hinzu, wie in Schritt 6.7.6 beschrieben. Lassen Sie die Dias trocknen und das Einbettmedium bei RT in der Haube aushärten.
      ACHTUNG: Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube.
  8. Decken Sie die Proben nach der Färbung mit einem Deckglas ab und werten Sie sie mit einem Lichtmikroskop aus. Histopathologische Veränderungen wurden auf der Grundlage von Verteilung, Schweregrad und morphologischen Merkmalen beschrieben.
  9. Führen Sie eine semiquantitative Verletzungsbewertung unter Verwendung einer 5-Punkte-Bewertungsskala (0 bis 4) durch, wobei der Schweregrad der Veränderungen auf der Grundlage von Kriterien berücksichtigt wird, die von Shackelford et al.27 erläutert und wie folgt zusammengefasst werden:
    Note 0: keine Veränderung
    Note 1: minimale Änderung. Die Wirkung ist auf dem Gewebe kaum sichtbar; klein und selten. Betrifft einen Teil des Gewebes von mindestens 10 %.
    Grad 2: Lichtwechsel. Stellt eine kleine histologische Veränderung dar. Diese Sorte wird verwendet, wenn das Gewebe oder seine Struktur eine Volumenveränderung zwischen 11 % und 20 % aufweist.
    Grad 3: mäßige Veränderung. Die Veränderung ist im Gewebe sichtbar. Der Grad zeigt das Vorhandensein von Schwankungen zwischen 21 % und 40 % des Gewebes oder seiner Struktur an
    Note 4: deutliche Veränderung. Überwältigende histologische Veränderung des Gewebes oder seiner Struktur. Schwankungen betreffen 41%-100% des Gewebes.
  10. Führen Sie quantitative histomorphometrische Analysen von Gebärmutter, Eierstock, Hoden und Schilddrüse durch. Untersuchen Sie Gewebeschnitte mit einem Bildanalysesystem, das auf ein optisches Mikroskop angewendet wird, und befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
    1. Gebärmutter: Messen Sie mit einem 2-fach-Objektiv die Gesamtfläche jedes Querschnitts des rechten Gebärmutterhorns, des äußeren und inneren Myometriums und des Uteruslumens. Berechnen Sie die Fläche des Endometriums und des Myometriums und das Verhältnis zwischen der Fläche des Endometriums und dem Myometrium28.
    2. Eierstock: Verwenden Sie einen der gesamten Abschnitte in der zentralen Position des Eierstocks, um Follikel in verschiedenen Entwicklungsstadien sichtbar zu machen; Zählen Sie die primären, sekundären, Corpus luteum-, Graaf- und atresischen Follikel mit einem 4x-Objektiv. Führen Sie eine Klassifizierung der Follikel nach Fortune29 durch. Messen Sie außerdem die Fläche des Eierstocks für jede Probe und seine Follikeldichte (Anzahl der Follikel/Eierstockfläche x 100)30.
    3. Hoden: Messen Sie mit dem 10-fach-Objektiv 20 Tubuli/Probe; Messen Sie außerdem die Gesamtlumenfläche, die Gesamtfläche, den Längsdurchmesser und den Querdurchmesser28.
    4. Schilddrüse: Messen Sie die folgenden Parameter: Follikeldichte (Verhältnis zwischen der Anzahl der Follikel und einer bestimmten Fläche, 10x Ziel); indirekte follikuläre Zellhöhe (mittleres Verhältnis von Follikelfläche und Kolloidfläche in fünf zufällig ausgewählten Follikeln/Probe 40x Objektiv); das mittlere Verhältnis der Follikelepithelflächen und der Anzahl der Zellkerne (im selben Follikel, um die Follikelreifung zu bestimmen); follikuläre Zellhöhe (Mittelwert von fünf Zellen Höhe in fünf zufällig ausgewählten Follikeln/Probe, 64x Objektiv)31.

7. Genexpression

  1. Bei beiden Modellen ist die Genexpressionsanalyse anhand von Leberproben durchzuführen, die bei -80 °C gelagert wurden. Befolgen Sie das Protokoll der vollständigen RNA-Aufreinigung mit einem Kit, beginnend mit einem Lysat aus tierischem Gewebe.
    1. Um das Leberlysat zu erhalten, mahlen Sie die Gewebeprobe (10 mg) mit einem Minipinner, fügen Sie der Gewebeprobe 600 μl RL BUFFER (im Lieferumfang enthalten) hinzu und mahlen Sie weiter, bis die Probe homogenisiert ist.
  2. Unmittelbar nach der Extraktion wird die erhaltene RNA quantifiziert und ihre Qualität (für die Denaturierung oder das Vorhandensein von Proteinrückständen) mit einem Fluorspektrometer bewertet. Führen Sie spektrophotometrische Absorptionsmessungen bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm durch, wo Nukleinsäuren bzw. Proteine absorbiert werden.
  3. Nach der Bewertung der Gesamt-RNA-Konzentration mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers wird das entsprechende Volumen, das 1 μg Gesamt-RNA enthält, von jeder Probe in cDNA umgekehrt transkribiert.
  4. Analysieren Sie die erhaltene cDNA mittels RT-PCR.
    1. Um die Genexpression von Genen von Interesse zu analysieren, wurden spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimer für jedes Zielgen sowie für das Referenzgen entwickelt, das konstitutiv exprimiert wird Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH). Verwenden Sie die Webanwendung Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), um die besten Primer auszuwählen, die die Spezifität der Paarung nur für das interessierende Gen garantieren, und erhalten Sie die von einem kommerziellen Anbieter synthetisierten Oligonukleotide. Die Sequenzen der verwendeten Primerpaare sind in Tabelle 5 aufgeführt.
    2. Resuspendieren Sie die lyophilisierten Primer mit RNAse-freiem destilliertem Wasser in einer Endkonzentration von 100 mM. Verwenden Sie ein spezielles Kit, um die qPCR-Analyse durchzuführen. Die Reaktionen werden in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt, wobei die getemperte cDNA 1:40 verdünnt wird. Laden Sie jede Probe in Duplikaten in 96-Well-PCR-Platten.
    3. Führen Sie qPCR-Läufe auf einem Thermocycler nach diesem Programm durch: 1 Zyklus bei 95 °C für 10 Minuten; 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 1 min. Führen Sie am Ende einen Dissoziationszyklus von 55 °C bis 95 °C (30 s/°C) durch, um die Spezifität des amplifizierten Produkts zu überprüfen. Mit der speziellen Software des Geräts können Sie für jede Probe Schwellenwerte (Zyklusschwelle, Ct) ermitteln. Drückt man die Ergebnisse als ΔΔ Ct (delta delta Ct) nach der Pfaffl-Formel32 aus:
      ΔCt Zielgen = Ct-Kontrolle - Ct-behandelt
      ΔCt Referenzgen = Ct-Kontrolle - Ct-behandelt
      ΔCt = ΔCt Zielgen - ΔCt Referenzgen

8. Datenanalyse

  1. Führen Sie die Datenverwaltung mithilfe einer Tabellenkalkulation durch. Führen Sie Analysen mit statistischer Analysesoftware durch. Entwerfen Sie Grafiken mit einer speziellen Software.
  2. Stellt die Körperzunahme, den Futterverbrauch, das absolute und relative Organgewicht, die Hormonserumspiegel, die gewebemorphometrischen Daten und die Genexpressionsdaten als mittlere ± Standardabweichung dar. Führen Sie eine nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Analyse durch, gefolgt von post-hoc-Paarvergleichen (Mann-Whitney-Test).
  3. Analysieren Sie histologische Daten mit einem 2-Wege-Fisher-Exact-Test, um signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe zu identifizieren, einschließlich Proben, die einer Kategorie ohne Bezug zu Schweregradabstufungen (Gesamtbefundinzidenz) zugeordnet sind. Verwenden Sie den Cochran-Armitage-Trendtest, um den Dosis-Wirkungs-Trend zu identifizieren. Betrachten Sie Unterschiede zwischen Gruppen als signifikant, wenn der p-Wert < 0,05 beträgt.

Ergebnisse

Wie von Tassinari et al.14 und von Tammaro et al.33 gezeigt, zeigten die folgenden Ergebnisse den Erfolg von GAHT an Ratten und die Angemessenheit der Modelle.

Es werden keine Mortalität oder abnormales Verhalten wie Aggressivität aufgezeichnet, und es werden keine klinischen Anzeichen von Toxizität oder Leiden (z. B. verminderte Aktivität, Piloerektion und ein ungepflegtes Aussehen) beobachtet

Diskussion

Die Implementierung von Nagetiermodellen, die GAHT nachahmen, ist entscheidend für die Untersuchung der potenziellen spezifischen Anfälligkeit und Vulnerabilität von TG-Menschen und der langfristigen Ergebnisse der Therapien, die in der Regel ihr ganzes Leben andauern.

Angesichts der geringen Anzahl ähnlicher Studien in der Literatur ist der kritische Punkt dieses Experiments die Auswahl der Dosen zum Festlegen der Modelle; Diese Dosen sollten niedrig genu...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die möglicherweise zu einem Interessenkonflikt führen könnten.

Danksagungen

Nichts.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical balance ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuge 5415 REppendorfFor eppendorf
Cyproterone AcetateSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for WindowsGraphPad Software
HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Imaging SoftwareNikonNIS-BR
JMP 10 statistical softwareSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopyNikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Portable Balances SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesDesigned by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
SensiFASTcDNA Synthesis KitBiolineBIO-6505350 reaction
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley rats male and femaleEnvigo8/9 weeks old
Standard dietsMucedola4RF18
T4(Thyroxine) ELISA KitELK BiotechnologyELK871696T
Testosterone enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Tissue processorShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KITNorgen1720050 column
Victor 3 Multilabel reader Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631

Referenzen

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