JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает разработку двух моделей грызунов, имитирующих гормональную терапию путем подкожного введения тестостерона или эстрадиола плюс ципротерона ацетата (используемого в терапии трансгендерных людей): установление доз, идентификация соответствующих биомаркеров и оценка эффектов.

Аннотация

Трансгендеры (ТГ) — это люди, чья гендерная идентичность и пол, присвоенные при рождении, не совпадают. Они часто проходят гендерно-утверждающую гормональную терапию (GAHT) — медицинское вмешательство, которое позволяет приобрести вторичные половые признаки, более соответствующие их индивидуальной гендерной идентичности, обеспечивая стабильные результаты в улучшении многочисленных социально-психологических переменных. Тем не менее, ГАХТ нацелен на различные системы организма, и некоторые побочные эффекты зарегистрированы, хотя еще не полностью идентифицированы и охарактеризованы. Таким образом, ТГ-люди, проходящие ГАХТ, могут рассматриваться как восприимчивая подгруппа населения, и особое внимание следует уделять в рамках оценки риска, например, с использованием целевых животных моделей. В настоящей работе описываются процедуры, установленные для реализации двух крысиных моделей, имитирующих GAHT: демаскулинизирующе-феминизирующая модель (dMF), имитирующая GAHT для женщин с ТГ, и дефеминизирующе-маскулинизирующая модель (dFM), имитирующая GAHT для мужчин с ТГ. Модели были реализованы путем введения тех же гормонов, которые используются для ГПТ человека, а именно, β-эстрадиола плюс ципротерона ацетат для dMF и тестостерона для dFM, теми же путями воздействия в течение 2-недельного периода. Крысы ежедневно проверяются во время лечения для оценки состояния здоровья и потенциально агрессивного поведения. При жертвоприношении образцы крови и тканей-мишеней были отобраны и сохранены для биохимического, молекулярного и гистопатологического анализа. Также были оценены параметры, специфичные для пола, а именно количество сперматозоидов и размеры клитора. Кроме того, изоформы CYP450, экспрессируемые исключительно и/или преимущественно в печени самцов и самок крыс, идентифицированы и охарактеризованы как новые биомаркеры для проверки успеха GAHT и установления модели. Поражение щитовидной железы также было изучено в качестве ключевой мишени в эндокринной системе.

Введение

Психологическое восприятие индивидуумом того, что он мужчина, женщина, ни то, ни другое, или что-то среднее между1 , называется гендерной идентичностью. Он может совпадать с биологическим полом (цисгендерный) или может быть другим (трансгендер – ТГ). ТГ-мужчина – это человек, рожденный женщиной, но идентифицирующий себя как мужчина. Женщина ТГ рождается мужчиной, но идентифицирует себя как женщину2. Подсчитано, что в настоящее время в мире насчитывается 25 миллионов человек сТГ3, большинство из которых страдают от гендерной дисфории, психологического состояния, характеризующегося несоответствием их пола и того, который им был присвоен при рождении4, что может привести к социальной дискриминации и трудностям на работе и в семье, часто приводя к депрессии. тревога и стресс5. По этим причинам люди с ТГ часто проходят гендерно-утверждающую гормональную терапию (GAHT) и/или операцию по утверждению пола. ГАХТ для мужчин с ТГ характеризуется введением тестостерона (Т) (Таблица 1), а для женщин с ТГ - эстрогенов (Е2) плюс антиандрогенов (Таблица 2)6.

ГАХТ обычно сохраняется в течение всей жизни человека, непрерывно воздействуя на эндокринную систему 7,8. Таким образом, важно проанализировать влияние GAHT на здоровье людей с ТГ и его потенциальные долгосрочные последствия. Более того, люди с ТГ, как и население в целом, подвергаются воздействию химических загрязнителей, в частности, эндокринных разрушителей (ЭД), которые нацелены на эндокринную систему в виде GAHT, что приводит к чрезмерной стимуляции.

ЭД — это группа химических веществ, влияющих на организмы и/или их потомство путем изменения различных гормональных и метаболических процессов, таких как секреция, активация, синтез, высвобождение и связывание естественных гормонов. Поскольку ЭД широко распространены в окружающей среде, продуктах питания и продуктах повседневного использования (например, пластиковых бутылках и контейнерах, вкладышах металлических пищевых банок, моющих средствах, антипиренах, продуктах питания, игрушках, косметике и пестицидах и т.д.), население в целом подвергается непрерывному воздействию в течение всей жизни. Кроме того, даже воздействие низких доз ЭД может привести к повреждению тканей и органов, а распространенным явлением, связанным с воздействием ЭД, является возникновение специфических для пола эффектов как у лабораторных животных, так и у человека11. Например, воздействие материала, контактирующего с пищевыми продуктами, бисфенола А (BPA), связано с такими рисками для здоровья, как эндометриоз и синдром поликистозных яичников у женщин, а также со снижением фертильности из-за его эстрогенных эффектов12. У мужчин BPA может снижать уровень и ухудшать качество спермы13. Кроме того, пестициды связаны с более высоким риском развития рака молочной железы у женщин и значительными проблемами с фертильностью у мужчин13 лет. До сих пор не было специальных инструментов для изучения токсикологических эффектов загрязнителей окружающей среды, включая ЭД, у людей с ТГ9.

Целью настоящего исследования является описание методов и параметров, выбранных для разработки двух животных моделей ТГ: демаскулинизирующе-феминизирующей модели (dMF) и дефеминизирующе-маскулинизирующей модели (dFM). В частности, оценивается выбор подходящих уровней дозы, времени и способа введения гормонов на основе современных методов лечения человека. Кроме того, идентифицируются и характеризуются тканевые и функциональные биомаркеры, которые однозначно определяют модели. Кроме того, подробно описаны эффективность и переносимость терапии у животных, а также выбор наиболее подходящих маркеров для использования в долгосрочных исследованиях вместе с методами, используемыми для таких целей.

Для того чтобы охарактеризовать модели, анализируются следующие конечные точки: уровень тестостерона (Т) в сыворотке крови (лучший биомаркер для оценки успешности GAHT в обеих моделях 9,15); уровень эстрадиола (Е2) в сыворотке крови (обе модели); тиреотропный гормон (ТТГ) и тироксин (Т4) (модель dMF); количество сперматозоидов (модель dMF); клиторальная размерность (модель dFM); гистопатологический анализ репродуктивных органов, печени и щитовидной железы (для обеих моделей). Кроме того, анализируется экспрессия генов следующих специфичных для пола изоформ цитохрома Р450 печени (CYP450s, для обеих моделей): CYP2C11 (специфически экспрессируется в мужской печени), CYP3A18 (экспрессируется в 25 раз больше в мужской печени, чем в женской), CYP2C12 (специфически экспрессируется в женской печени) и CYP2C6 (преимущественно экспрессируется в женской печени, но присутствует на более низких уровнях. также и у самца).

протокол

Исследования проводятся в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС, Законодательным декретом No 26 от 4 марта 2014 года и Принципами надлежащей лабораторной практики ОЭСР (GLP). Протокол исследования был одобрен Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 806/2021-PR). Здесь приобретаются 16 молодых половозрелых крыс Спрэг-Доули обоего пола (304 ± 13 г самцов крыс и 190 ± 7 г самок крыс в возрасте 8-9 недель) и размещаются по двое в клетке в стандартных лабораторных условиях (22 ± 0,5 °C, относительная влажность 50%-60%, 12 часов чередования темного света и 12-14 воздухообменов в час) с водой и пищей, доступными ad libitum. Во всех клетках, для обогащения окружающей среды каждого животного, вставляйте деревянные грызуны и еженедельно заменяйте их.

ПРИМЕЧАНИЕ: Животные в возрасте 8-9 недель были выбраны, так как GAHT может начаться в подростковом возрасте (стадии Таннера 2-3), что соответствует 8-9 неделям у грызунов, и длится долго, потенциально в течение всейжизни TG людей.

1. Определение размера группы и уход за животными

  1. В качестве модели следует использовать молодых взрослых самцов и самок крыс породы Спрэг-Доули (в возрасте 8-9 недель), поскольку крысы являются предпочтительным видом, указанным ОЭСР (например, Руководящим принципом 421 «Скрининговый тест на репродуктивную токсичность/токсичность для развития») и единственным видом грызунов, предложенным и рассмотренным в Руководящем принципе ОЭСР 407 (28-дневное исследование пероральной токсичности при повторной дозе у грызунов, обновленное параметрами для обнаружения ЭИ).
  2. Используйте программное обеспечение G*Power для определения размера группы. Для моделей dFM и dMF выберите четыре тестовые группы: одну контрольную группу (C) и три группы животных, получавших различные дозы GAHT. Сделайте определение размера с учетом сравнения между двумя группами (доза лечения против С) с помощью критерия Манна-Уитни, двусторонний уровень значимости альфа = 0,0167 (соответствует альфа = 0,05 с поправкой Бонферрони, примененной к 3 сравнениям между каждой лечебной дозой и С), и 1-бета степень = 0,80.
    1. Рассчитанное количество крыс/групп выглядит следующим образом:
      для модели dFM, животные/группа n=4, согласно Kinnear et al.18 , указывающим после 2 недель лечения, следующие уровни: в контрольной группе: 0,2 ± 0,3 нг/мл, в группе гормональной терапии: 16 ± 5 нг/мл (среднее ± стандартное отклонение), что соответствует размеру эффекта, измеренному с помощью d Коэна = 4,46 (очень большой эффект).
      для модели dMF: животные/группа n=3, согласно Gómez et al.19 , указывающей на то, что после 2 недель лечения были установлены следующие уровни: контрольная группа: 1,901 ± 0,413 нг/мл и группа гормональной терапии: 0,043 ± 0,023 нг/мл (среднее значение ± стандартной ошибке), соответствующее размеру эффекта, измеренному с помощью d Коэна = 6,35 (очень большой эффект).
    2. Чтобы совместить две модели, выберите n=4 животных для каждого пола/группы, что в сумме составит N = 32 животных.
  3. После 1 недели акклиматизации разделить крыс по полу на две экспериментальные группы (dMF и dFM, 4 крысы в группе), каждая из которых состоит из одного C (контрольный самец, CM и контрольная самка, CF) и трех групп лечения выбранной GAHT.
  4. Наблюдайте за всеми крысами 2 раза в день (в 8:30 утра и 4:00 вечера), чтобы проверить общее состояние здоровья и потенциальную агрессивность из-за введения ГАХТ. Регистрируйте массу тела (МТ) и потребление корма 2 раза в неделю с помощью аналитических весов с функцией динамического взвешивания, оптимальной для веса лабораторных животных.
  5. В экспериментальной модели dFM измерьте диаметр клитора всех крыс непосредственно перед началом лечения (точка 0) и в конце лечения (точка 13) с помощью цифрового датчика для точных показаний.
  6. Взвесьте всех животных перед жертвоприношением и, в модели dMF, сразу после жертвоприношения, удалите придатки яичков, чтобы выполнить подсчет сперматозоидов.

2. Подбор и приготовление дозы

  1. Используйте следующие три дозы гормонов для введения крысам с dFM: 5, 10,5 и 22,5 мг/кг в неделю, для модели dMF используйте следующие три выбранных уровня дозы (DL): DL1 E2 0,045 мг/кг + CPA 0,2 мг/кг, DL2 E2 0,09 мг/кг + CPA 0,2 мг/кг и DL3 E2 0,18 мг/кг + CPA 0,2 мг/кг.
    Примечание: Все дозы подобраны с учетом основных клинических рекомендаций для человека, используемых для пациентов с ТГ15 , и ограниченных данных, имеющихся в литературе.
  2. Готовьте все исходные растворы еженедельно, используя химический защитный колпак. Правильно смешайте все вещества в кунжутное масло в качестве носителя, обеспечив их полную растворимость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеих моделей используйте калькулятор преобразования дозы (https://dosecal.cftri.res.in/), чтобы ввести дозу для конвертации, вид, для которого была установлена доза, вид животных и вес, для которого нужно преобразовать дозу. Для модели dFM (табл. 3), гормональная терапия человека, максимальная доза 100 мг Т в неделю20. Доза, рассчитанная на крыс, составляет 10,5 мг/кг Т в неделю. Вторая доза составляет 22,5 мг/кг в неделю у18 крыс. Третья доза составляет 5 мг/кг в неделю, определяемая путем поддержания коэффициента 2,1 между двумя расчетными дозами. Для модели dMF см. таблицу 4, дозировки основаны на рекомендованных режимах для человека21 и данных, полученных в исследованиях in vivo 14,19,22.

3. Обращение с животными

  1. Выполняют подкожное введение Т (для модели dFM) и Е2 плюс CPA (для модели dMF) путем защипывания и подтяжки кожи в месте инъекции, образуя своеобразный занавес. Затем введите иглу шприца объемом 1 мл параллельно спине животного. Оказавшись внутри, медленно введите необходимый объем (100 μL для T; 200 μL для E2+CPA)23.
    1. Лечат животных следующим образом: для модели dFM вводят Т-энантат, растворенный в кунжутном масле (носитель) 2 раза в неделю в течение 2 недель (100 мкл на каждую подкожную инъекцию Т). Для модели dMF вводите E2 плюс ацетат CPA, растворенный в кунжутном масле (носитель) 5 раз в неделю в течение 2 недель (200 мкл для каждой подкожной инъекции). С крысами группы С обращайтесь так же, как и с транспортным средством (кунжутное масло).

4. Забор крови, жертвоприношения и забор образцов тканей

  1. После 2 недель лечения, непосредственно перед жертвоприношением, используйте систему газообразной анестезии и обезболите всех животных. Индуцировать анестезию дозой от 2% до 3,5% изофлурана в 100% кислороде со скоростью 1,5 л/мин до потери рефлексов в прозрачной полистирольной индукционной камере. Поместите крысу в положение лежа на грелку и регулируйте дозу изофлурана в поддерживающей дозе от 1,5% до 3,5%, вводимой стандартной маской из носа крысы, на протяжении всей процедуры забора внутрисердечной крови.
  2. Приготовьте шприц объемом 5 мл с иглой 21G, устраняя вакуум. Прощупывая сердце пальцами, осторожно введите иглу в боковую грудную стенку перпендикулярно телу примерно в точку согнутых локтей, между ребрами 5 и 6. Попадая внутрь сердечного желудочка, кровь капиллярным путем поступает в шприц. Медленно и непрерывно втягивайте поршень шприца, пока не начнет течь кровь.
  3. После забора крови поместите крыс в камеру сСО2 для проведения эвтаназии с использованием асфиксииСО2 с частотой заполнения 30%-70% смещения объема камеры в минуту. Через 2-3 минуты убедитесь в смерти животных, контролируя дыхание и сердцебиение24.
  4. После жертвоприношения поместите каждое животное на стол для вскрытия в положение лежа на спине, передними ногами вверх, а задними ногами вниз, и зафиксируйте их булавками. Сбрызните живот животного дезинфицирующим раствором.
  5. Иссекаются следующие органы: яички, придатки яичек, матка, яичники, печень и щитовидная железа. Взвесьте и храните их в пробирках объемом 50 мл с 35 мл 10% буферизованного формалина (для всех органов) или раствора Буэна (только для яичек) или соберите их в криогенные пробирки (орган/пробирка) и немедленно заморозьте в жидком азоте (для хранения при -80 °C).
    1. Во-первых, разрежьте кожу ножницами по средней линии, от лобка до верхней части живота. Сделайте два боковых разреза на грудной клетке и отразите кожу с обеих сторон разреза, чтобы обнажить грудные внутренности.
    2. Сначала удалите репродуктивные органы; У самцов крыс удаляют семенники, парные органы овальной формы, расположенные в брюшной полости, во внутрибрюшном положении (мошоночный мешок). Разрежьте и прижмите мошоночный мешок, чтобы яички торчали наружу, затем осторожно возьмитесь за них. Удерживайте висцеральный жир плоскогубцами, затем отрежьте яички от внутренностей. После иссечения взвесьте и храните яички в растворе Буэна для гистопатологического анализа.
    3. У самок крыс сначала деликатно захватывают матку, затем вырезают яичники (которые расположены на концах обоих маточных рогов) из висцеральной жировой ткани. После иссечения взвесьте яичники.
    4. Как у самок, так и у самцов крыс переходят на правую сторону брюшной полости, где находится печень. Печень является многодольчатым органом, и можно выделить много частей: левую медиальную (меньшую), левую латеральную (большую), правую медиальную (меньшую), правую латеральную (большую), хвостатую и квадратную долю25. Возьмитесь за печень щипцами, стараясь не сломать ее. Обхватите мечевидный отросток плоскогубцами и полностью разрежьте диафрагму ножницами.
    5. С помощью щипцов подтянуть мечевидный отросток и извлечь печень из брюшной полости. Отделите печень от диафрагмы ножницами. После этого взвесьте печень и уберите на хранение.
    6. Для извлечения щитовидной железы с помощью ножниц разрезают перпендикулярно вдоль шеи животного, удаляют кожу и мускулатуру, а также аккуратно обрезают концы трахеи, в которой находится щитовидная железа. Сохраните щитовидную железу для дальнейшего анализа26.
  6. Выполните подсчет сперматозоидов, как описано ниже.
    1. После удаления яичка захватите придаток яичка, который прикреплен к заднему краю соответствующего яичка и содержится в мошонке.
    2. В этом эксперименте образцы спермы берутся из хвоста правого придатка яичка. Во время сбора очистите хвост от жира и соединительной ткани с помощью ножниц, отделите его от оставшейся части и поместите в чашку Петри (35 мм х 10 мм), содержащую 1 мл ДМЭМ. Разрежьте ножницами и налейте с помощью пастеровской пипетки, чтобы облегчить высвобождение содержимого.
    3. Всю полученную жидкость переложите в пробирку объемом 15 мл и доведите объем до 10 мл с помощью DMEM (коэффициент разведения 1:10=0,1). Пипеткой нагнетайте содержимое до гомогенизации и создания суспензии. После легкого встряхивания возьмите 10 мкл суспензии для загрузки камеры Нейбауэра. Загрузите камеру и через 3 минуты после загрузки камеры начните отсчет.

5. Иммуноферментный анализ (ИФА)

  1. Соберите образцы крови (около 2-5 мл на животное) в пробирки объемом 2 мл и дайте им свернуться при комнатной температуре в течение 1 часа. Открутите все образцы крови в центрифуге 2 раза в течение 15 минут при 4 °C и 3000 x g.
  2. Центрифугированная кровь имеет многослойный вид с тремя слоями разного цвета. Верхний слой состоит из плазмы (обычно желтого или прозрачного), жидкой части крови; слой под плазмой может иметь белесую или серую окраску и является шерстью баффи. Самый нижний слой содержит эритроциты, а цвет может казаться темно-красным или ярко-красным. Чтобы определить уровень половых гормонов, соберите сыворотку всех образцов с помощью пипетки (не трогая охристую шерсть или слои эритроцитов), разделите их на аликвоты (500 μл) и храните при температуре -80 °C.
  3. В обеих моделях проведите тест ИФА для обнаружения и/или измерения наличия белков, антител или антигенов в образце для определения половых гормонов. Используйте прямой метод и следуйте инструкциям каждого набора ИФА. В этом исследовании у крыс определяли сывороточные уровни следующих гормонов: Е2, Крысиный эстрадиол ИФА; Т, мышь/крыса Тестостерон Элиза; ТТГ, Крысиный ИФА Набор и Т4, Крысиный ИФА Набор.

6. Гистопатологический анализ

  1. Подготовьте гистологические препараты тканей в соответствии со следующими процедурами.
  2. Зафиксировать образцы матки, яичников, щитовидной железы и печени в момент экстракции в 10% буферном формалине не менее 48 ч.
    ВНИМАНИЕ: Работайте под химическим колпаком. Не вдыхайте вещество/смесь. Избегайте образования паров/аэрозолей.
  3. Промойте образцы под проточной водой в течение 1 ч, а затем храните в 80% этиловом спирте (C2H5OH) до обработки, чтобы сохранить протоплазматическую структуру от изменений, вызванных клеточной гибелью.
  4. Зафиксируйте яичко в растворе Буэна, состоящем из 15 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты, 5 мл концентрированного формалина (33%-40%) и 1 мл ледяной уксусной кислоты на 48 ч. Промойте образцы 80% этиловым спиртом.
    ВНИМАНИЕ: Работайте под химическим колпаком.
  5. Выполнение включения в твердый парафин с помощью автоматического тканевого процессора. В конце процесса включения поместите образцы в небольшие металлические контейнеры, в которые был насыпан расплавленный парафин, и охладите на замороженной пластине, формируя блоки для разреза. Ориентируйте их в зависимости от желаемого сечения резки.
  6. После этого разрежьте образцы с помощью вращающегося микротома. Соберите срезы размером 5-6 мкм с помощью небольших щеток, опустите их в воду при температуре 37 °C на несколько секунд и поместите на предметные стекла микроскопа. Оставьте стекла стечь перпендикулярно на несколько минут и высушите их в духовке при температуре 36 °C не менее 1 часа.
  7. Проводите окрашивание гематоксилином и эозином, как описано ниже.
    1. Депарафинизируйте предметные стекла, погрузив их в очищающий агент терпенового происхождения (заменитель ксилола) на 5 минут.
    2. Восстановите гидратацию предметных стекол, окунув их в следующую серию отсортированного этанола. Для каждого раствора 2 минуты на погружение: 100% этанол, 95% этанол, 80% этанол, 50% этанол и дистиллированная вода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут быть точкой остановки для протокола, и горки могут быть оставлены в RT в воде на несколько часов. По желанию предметные стекла также могут храниться при температуре 4 °C в воде.
    3. Поместите предметные стекла в гематоксилин Майера на 5 минут. Сразу же переложите их обратно в емкость с водой из-под крана на 5 минут. Налейте воду из-под крана в дальний от секций задний угол контейнера. Периодически опорожняйте емкость до тех пор, пока фиолетовая окраска в воде не перестанет присутствовать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы секции не отслаивались от горок, не направляйте воду прямо на горки.
    4. Поместите предметные стекла в водный раствор эозина Y 1% на 2 мин. Переложите предметные стекла в дистиллированную воду на 15 с. Обезвожьте предметные стекла, окунув их в следующую серию сортированного этанола. На каждый раствор 15 с на погружение: 50% этанола, 80% этанола, 95% этанола.
    5. Поместите предметные стекла в 100% этанол на 1 минуту и замените его на свежий 100% этанол еще на 1 минуту. Поместите предметные стекла в очищающий агент терпенового происхождения (заменитель ксилола) на 2 минуты и замените его на свежий очищающий агент терпенового происхождения (заменитель ксилола) еще на 2 минуты. Снимайте по одному предметному стеклу за раз и устанавливайте покровную крышку.
    6. Накройте секции монтажным материалом и поместите покровное стекло на нижнюю часть предметного стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что монтажная среда притягивает затвор в нужное положение. Если покровная крышка не плоская, аккуратно постучите по ней. Промокните излишки монтажного материала бумажным полотенцем.
    7. Окуните чистящую салфетку в очищающее средство терпенового происхождения (заменитель ксилола) и протрите заднюю часть предметного стекла, чтобы удалить капнувшую среду. Поместите предметное стекло на подвижную твердую поверхность, как кусок картона. Добавьте coverslip ко всем оставшимся слайдам, как описано в шаге 6.7.6. Дайте слайдам высохнуть, а монтажной среде затвердеть при температуре RT в капоте.
      ВНИМАНИЕ: Работайте под химическим колпаком.
  8. После окрашивания накройте образцы покровным стеклом и оцените их с помощью оптического микроскопа. Гистопатологические изменения были описаны на основе распространения, тяжести и морфологических характеристик.
  9. Оценивайте травмы полуколичественно, используя 5-балльную шкалу оценки (от 0 до 4), учитывая серьезность изменений на основе критериев, объясненных Shackelford et al.27 и обобщенных следующим образом:
    Класс 0: без изменений
    1 класс: минимальная сдача. Эффект едва заметен на тканях; небольшие и нечастые. Поражает участок ткани меньше или равный 10%.
    Степень 2: изменение освещения. Представляет собой небольшое гистологическое изменение. Этот сорт используется, когда ткань или ее структура показали изменение объема от 11% до 20%.
    3 степень: умеренное изменение. Изменения проявляются в тканях. Степень указывает на наличие вариаций от 21% до 40% ткани или ее структуры
    4 степень: заметное изменение. Подавляющее гистологическое изменение ткани или ее структуры. Вариации затрагивают 41%-100% ткани.
  10. Выполните количественный гистоморфометрический анализ матки, яичников, яичек и щитовидной железы. Исследуйте срезы тканей с помощью системы анализа изображений, примененной к оптическому микроскопу, и выполните описанные ниже действия.
    1. Матка: С помощью объектива 2x измерьте общую площадь каждого поперечного участка правого маточного рога, наружного и внутреннего миометрия и просвета матки. Рассчитайте площадь эндометрия и миометрия и соотношение между площадью эндометрия и миометрием28.
    2. Яичники: используйте один из целых участков в центральном положении яичника для выявления фолликулов на различных стадиях развития; подсчитывайте первичные, вторичные, желтое тело, Грааф и атрезические фолликулы с помощью объектива 4x. Выполните классификацию фолликулов по версии Fortune29. Кроме того, измерьте площадь яичника для каждого образца и его плотность фолликулов (количество фолликулов/площадь яичников x 100)30.
    3. Яички: Используя объектив 10x, измерьте 20 канальцев на образец; Кроме того, измерьте общую площадь просвета, общую площадь, продольный диаметр и поперечный диаметр28.
    4. Щитовидная железа: Измерьте следующие параметры: плотность фолликулов (соотношение между количеством фолликулов и заданной областью, 10x объективное); непрямая высота фолликулярных клеток (среднее соотношение площади фолликула и коллоидной площади в пяти случайно выбранных фолликулах/образец в 40 раз объективно); среднее соотношение участков фолликулярного эпителия и количества ядер (в одном фолликуле для определения созревания фолликулов); Высота фолликулярных клеток (средняя высота пяти клеток в пяти случайно выбранных фолликулах/образце, 64x объективная)31.

7. Экспрессия генов

  1. Для обеих моделей выполните анализ экспрессии генов с использованием образцов печени, хранящихся при температуре -80 °C. Соблюдайте протокол тотальной очистки РНК с помощью набора, начиная с лизата тканей животного происхождения.
    1. Чтобы получить лизат печени, измельчите образец ткани (10 мг) с помощью мини-булавки, добавьте 600 мкл RL BUFFER (входит в комплект) к образцу ткани и продолжайте измельчать до тех пор, пока образец не будет гомогенизирован.
  2. Сразу после экстракции количественно оцените полученную РНК и оцените ее качество (на предмет денатурации или наличия каких-либо белковых остатков) с помощью флуороспектрометра. Выполнение спектрофотометрических измерений поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм, где соответственно поглощаются нуклеиновые кислоты и белки.
  3. После оценки концентрации общей РНК с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя выполните обратную транскрибацию соответствующего объема, содержащего 1 г общей РНК, из каждого образца в кДНК.
  4. Проанализировать полученную кДНК методом ОТ-ПЦР.
    1. Для анализа экспрессии генов, представляющих интерес, были разработаны специфические прямые и обратные праймеры для каждого гена-мишени, а также для референсного гена конститутивно экспрессируемой глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH). Используйте веб-приложение Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) для выбора лучших праймеров, которые гарантировали бы специфичность спаривания только с интересующим геном и получения олигонуклеотидов, синтезированных коммерческим поставщиком. Последовательности используемых пар праймеров приведены в таблице 5.
    2. Ресуспендируйте лиофилизированные праймеры дистиллированной водой без РНКазы в конечной концентрации 100 мМ. Используйте специальный набор для проведения количественного ПЦР-анализа. Проводите реакции в конечном объеме 20 мкл, разбавляя отожженную кДНК в соотношении 1:40. Загрузите каждый образец в двух экземплярах в 96-луночные ПЦР-планшеты.
    3. Выполните прогоны количественной ПЦР на термоамплификаторе по следующей программе: 1 цикл при 95 °C в течение 10 мин; 40 циклов при 95 °C в течение 15 с, 58 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 мин. В конце выполните цикл диссоциации от 55°C до 95°C (30 с/°C), чтобы проверить специфичность амплифицированного продукта. Используя специальное программное обеспечение машины, получите пороговые значения цикла (Cycle Threshold, Ct) для каждого образца. Выразим результаты в виде ΔΔ Ct (дельта дельта Ct) по формуле Пфаффля32:
      Ген-мишень ΔCt = Ct контроль - Ct лечится
      Референсный ген ΔCt = Ct контроль - Ct лечится
      ΔCt = ΔCt Целевой ген - ΔCt Референсный ген

8. Анализ данных

  1. Выполняйте управление данными с помощью электронной таблицы. Выполняйте анализ с помощью программного обеспечения для статистического анализа. Создавайте графику с помощью специального программного обеспечения.
  2. Представляйте прирост массы тела, потребление корма, абсолютную и относительную массу органов, уровни гормонов в сыворотке крови, морфометрические данные тканей и данные экспрессии генов в виде среднего ± стандартного отклонения. Выполните непараметрический анализ Краскела-Уоллиса с последующим последующим попарным сравнением (критерий Манна-Уитни).
  3. Проанализируйте гистологические данные с помощью 2-факторного точного теста Фишера, чтобы выявить значимые отличия от контрольной группы, включая образцы, которые отнесены к категории без какой-либо ссылки на градации тяжести (общая частота обнаружения). Используйте тест Кокрана-Армитажа для определения тренда «доза-реакция». Рассматривайте различия между группами как значимые, если p-значение равно < 0,05.

Результаты

Как показали Tassinari et al.14 и Tammaro et al.33, следующие результаты показали успех GAHT на крысах и пригодность моделей.

Смертность или аномальное поведение, такое как агрессивность, не зарегистрировано, а также не наблюдаются клинические ...

Обсуждение

Внедрение моделей грызунов, имитирующих ГАХТ, имеет решающее значение для изучения потенциальной специфической восприимчивости и уязвимости людей с ТГ, а также долгосрочных результатов терапии, обычно длящихся всю их жизнь.

Учитывая небольшое количе?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые потенциально могли бы создать конфликт интересов.

Благодарности

Никакой.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical balance ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuge 5415 REppendorfFor eppendorf
Cyproterone AcetateSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for WindowsGraphPad Software
HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Imaging SoftwareNikonNIS-BR
JMP 10 statistical softwareSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopyNikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Portable Balances SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesDesigned by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
SensiFASTcDNA Synthesis KitBiolineBIO-6505350 reaction
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley rats male and femaleEnvigo8/9 weeks old
Standard dietsMucedola4RF18
T4(Thyroxine) ELISA KitELK BiotechnologyELK871696T
Testosterone enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Tissue processorShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KITNorgen1720050 column
Victor 3 Multilabel reader Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631

Ссылки

  1. Rokach, A., Patel, K. . Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. . Gender Dysphoria. , (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343 (2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877 (2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. &. #. 8. 2. 1. 7. ;., Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640 (2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. . Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002 (2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474 (2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839 (2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716 (2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5 (2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013 (2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

dMFdFMCYP450

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены