Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מתאר את הפיתוח של שני מודלים של מכרסמים המחקים טיפולים הורמונליים מאשרים מגדר באמצעות מתן תת עורי של טסטוסטרון או אסטרדיול בתוספת ציפרוטרון אצטט (המשמש בטיפולים אנושיים לאנשים טרנסג'נדרים): קביעת המינונים, זיהוי סמנים ביולוגיים רלוונטיים והערכת ההשפעות.

Abstract

אנשים טרנסג'נדרים (TG) הם אנשים שזהותם המגדרית והמין שהוקצו להם בלידה אינם תואמים. לעתים קרובות הם עוברים טיפול הורמונלי מאשר מגדר (GAHT), התערבות רפואית המאפשרת רכישת מאפייני מין משניים התואמים יותר את זהותם המגדרית האינדיבידואלית, ומספקת תוצאות עקביות בשיפור משתנים סוציו-פסיכולוגיים רבים. עם זאת, GAHT מכוון למערכות גוף שונות, וכמה תופעות לוואי נרשמות, אם כי עדיין לא זוהו ואופיינו במלואן. לכן, אנשים TG העוברים GAHT עשויים להיחשב כתת-קבוצה רגישה של אוכלוסייה ויש להקדיש תשומת לב ספציפית במסגרת הערכת הסיכונים, למשל, באמצעות שימוש במודלים ממוקדים של בעלי חיים. העבודה הנוכחית מתארת את הנהלים שנקבעו ליישום שני מודלים של עכברושים המחקים GAHT: המודל להסרת גבריות-נשיות (dMF) המחקה את ה-GAHT עבור נשים TG ומודל ה-defeminizing-masculinizing (dFM) המחקה את ה-GAHT עבור גברים TG. המודלים יושמו באמצעות מתן אותם הורמונים המשמשים ל-GAHT אנושי, כלומר, β-אסטרדיול בתוספת ציפרוטרון אצטט ל-dMF וטסטוסטרון ל-dFM, באותם דרכי חשיפה לתקופה של שבועיים. חולדות נבדקות מדי יום במהלך הטיפול כדי להעריך את המצב הבריאותי והתנהגויות שעלולות להיות תוקפניות. בעת ההקרבה, דם ורקמות מטרה נדגמו ואוחסנו לניתוח ביוכימי, מולקולרי והיסטופתולוגי. כמו כן הוערכו פרמטרים ספציפיים למין, כלומר ספירת זרע ומידות הדגדגן. בנוסף, איזופורמים של CYP450, המתבטאים באופן בלעדי ו/או מועדף בכבד של חולדות זכרים ונקבות, מזוהים ומאופיינים כסמנים ביולוגיים חדשים כדי לאמת את הצלחת GAHT ולקבוע את המודל. מעורבות בלוטת התריס נחקרה גם כמטרה מרכזית במערכת האנדוקרינית.

Introduction

התפיסה הפסיכולוגית של הפרט לגבי היותו זכר, נקבה, אף אחד מהם, שניהם, או איפשהו בין1 נקראת זהות מגדרית. זה יכול להתאים למין הביולוגי (סיסג'נדר) או יכול להיות שונה (טרנסג'נדר - TG). גבר TG הוא אדם שנולד כנקבה אך מזהה את עצמו כגבר. אישה TG נולדת כזכר אך מזהה את עצמה כאישה2. ההערכה היא כי נכון לעכשיו, ישנם 25 מיליון TG ברחבי העולם3, רובם סובלים מדיספוריה מגדרית, מצב פסיכולוגי המאופיין בחוסר התאמה בין המגדר שלהם לזה שהוקצה להם בלידה4, מה שעלול לגרום לאפליה חברתית וקשיים בעבודה ובמשפחה, מה שמוביל לעתים קרובות לדיכאון, חרדה ומתח5. מסיבות כאלה, א/נשים TG עוברות לעתים קרובות טיפול הורמונלי לאישור מגדר (GAHT) ו/או ניתוחים לאישור מגדר. GAHT עבור גברים TG מאופיין במתן טסטוסטרון (T) (טבלה 1), ועבור נשים TG, אסטרוגנים (E2) בתוספת אנטיאנדרוגנים (טבלה 2)6.

GAHT נמשך בדרך כלל לכל חייו של האדם, ופועל ברציפות על המערכת האנדוקרינית 7,8. לכן, חשוב לנתח את ההשפעה של GAHT על בריאותם של אנשים TG ואת ההשפעות הפוטנציאליות ארוכות הטווח שלו. יתר על כן, אנשים TG חשופים, כאוכלוסייה הכללית, למזהמים כימיים - בפרט, המשבשים האנדוקריניים (ED) - המכוונים למערכת האנדוקרינית כ-GAHT, וכתוצאה מכך גירוי יתר9.

הפרעות זקפה הן קבוצה של כימיקלים המשפיעים על האורגניזמים ו/או על צאצאיהם על ידי שינוי תהליכים הורמונליים ומטבוליים שונים, כגון הפרשה, הפעלה, סינתזה, שחרור וקשירה של הורמונים טבעיים. מכיוון שהפרעות זקפה נפוצות בסביבה, מזון ומוצרים לשימוש יומיומי (למשל, בקבוקי פלסטיק ומיכלים, ספינות של פחיות מזון ממתכת, חומרי ניקוי, מעכבי בעירה, מזון, צעצועים, קוסמטיקה וחומרי הדברה וכו') האוכלוסייה הכללית חשופה באופן רציף במהלך כל החיים10. בנוסף, אפילו חשיפה במינון נמוך להפרעות זקפה עלולה להוביל לנזק לרקמות ולאיברים, ותופעה שכיחה הקשורה לחשיפה להפרעות זקפה היא התרחשות של השפעות ספציפיות למין הן בחיות מעבדה והן בבני אדם11. כדוגמה, חשיפה לחומר המגע עם מזון, ביספנול A (BPA), קשורה לסיכונים בריאותיים כמו אנדומטריוזיס ותסמונת השחלות הפוליציסטיות אצל נשים, כמו גם לירידה בפוריות, בשל השפעותיו האסטרוגניות12. אצל גברים, BPA יכול להוריד את הרמות ולהפחית את איכות הזרע13. בנוסף, חומרי הדברה קשורים לסיכון גבוה יותר לסרטן השד אצל נשים ולבעיות פוריות משמעותיות אצל גברים13. עד כה, אין כלים ספציפיים זמינים לחקר ההשפעות הטוקסיקולוגיות של מזהמים סביבתיים, כולל הפרעות זקפה, באנשים TG9.

מטרת המחקר הנוכחי היא לתאר שיטות ופרמטרים שנבחרו לפיתוח שני מודלים של בעלי חיים TG: מודל דה-גברי-נשי (dMF) ומודל דפמיניזציה-גבריות (dFM). בפרט,מוערכים הבחירה של רמות מינון מתאימות, זמן ואופן מתן ההורמונים על בסיס הטיפולים הנוכחיים בבני אדם. יתר על כן, רקמות וסמנים ביולוגיים פונקציונליים המגדירים את המודלים באופן ייחודי מזוהים ומאופיין. בנוסף, היעילות והסבילות של טיפול בבעלי חיים כמו גם בחירת הסמנים המתאימים ביותר לשימוש במחקרים ארוכי טווח, מתוארים בפירוט יחד עם הטכניקות המשמשות למטרות אלה.

על מנת לאפיין את המודלים, מנותחים נקודות הקצה הבאות: רמת טסטוסטרון (T) בסרום (הסמן הביולוגי הטוב ביותר להערכת הצלחת GAHT בשני המודלים 9,15); רמת הסרום של אסטרדיול (E2) (שני הדגמים); הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH) ותירוקסין (T4) (מודל dMF); ספירת זרע (מודל dMF); ממד הדגדגן (דגם dFM); ניתוח היסטופתולוגי של איברי הרבייה, הכבד ובלוטת התריס (לשני הדגמים). בנוסף, מנותחים גם ביטוי הגנים של האיזופורמים הבאים של ציטוכרום P450 בכבד הספציפי למין (CYP450s, עבור שני המודלים)16,17: CYP2C11 (מתבטא במיוחד בכבד הגברי), CYP3A18 (מתבטא פי 25 יותר בכבד גברי מאשר בנקבה), CYP2C12 (מתבטא במיוחד בכבד הנשי), ו-CYP2C6 (מתבטא בעיקר בכבד נקבי, אך קיים ברמות נמוכות יותר, גם בזכר).

Protocol

המחקרים מבוצעים בהתאם להנחיה 2010/63/EU, צו החקיקה האיטלקי מס' 26 מיום 4 במרץ 2014, ועקרונות ה-OECD לשיטות מעבדה טובות (GLP). פרוטוקול המחקר אושר על ידי משרד הבריאות האיטלקי (אישור מס' 806/2021-PR). כאן, 16 חולדות Sprague-Dawley צעירות בוגרות מינית משני המינים (304 ± 13 גרם חולדות זכרים ו-190 ± 7 גרם נקבות חולדות, בנות 8-9 שבועות) נרכשות ומאוחסנות בשני כלובים בתנאי מעבדה סטנדרטיים (22 ± 0.5 מעלות צלזיוס, 50%-60% לחות יחסית, 12 שעות של חילופי אור כהה עם 12-14 החלפות אוויר בשעה) עם מים ומזון זמינים אד ליביטום. בכל הכלובים, להעשרה הסביבתית של כל בעל חיים, הכניסו קוביות כרסום עץ והחליפו אותן מדי שבוע.

הערה: בעלי החיים בגילאי 8-9 שבועות נבחרו מכיוון ש-GAHT יכול להתחיל במהלך גיל ההתבגרות (שלבי טאנר 2 עד 3), המקבילים ל-8-9 שבועות במכרסמים, והוא נמשך זמן רב, פוטנציאלי לכל חייהם של אנשים TG9.

1. גודל קבוצתי וטיפול בבעלי חיים

  1. השתמש בחולדות Sprague-Dawley בוגרות צעירות (בנות 8-9 שבועות) כמודל מכיוון שחולדה היא המין המועדף שצוין על ידי ה-OECD (למשל, הנחיה 421 בדיקת סינון רעילות רבייה/התפתחותית) ומין המכרסמים היחיד שהוצע ונלקח בחשבון בהנחיה 407 של ה-OECD (מחקר רעילות אוראלית של 28 יום במינון חוזר במכרסמים, מעודכן בפרמטרים לזיהוי EIs).
  2. השתמש בתוכנת G*Power לגודל הקבוצה. הן עבור מודלי dFM והן עבור dMF, בחר ארבע קבוצות בדיקה: קבוצת ביקורת אחת (C) ושלוש קבוצות של בעלי חיים שטופלו במינונים שונים של GAHT. בצע את הגודל בהתייחס להשוואה בין שתי קבוצות (מינון טיפול לעומת C) עם מבחן מאן-וויטני, רמת מובהקות דו-זנבית אלפא = 0.0167 (המקבילה לאלפא = 0.05 עם תיקון בונפרוני שהוחל על 3 ההשוואות בין כל מנת טיפול ל-C), ועוצמה של 1-בטא = 0.80.
    1. המספר המחושב של חולדות/קבוצות הוא כדלקמן:
      עבור מודל dFM, בעלי חיים/קבוצה n=4, על פי Kinnear et al.18 המציין לאחר שבועיים של טיפול, את הרמות הבאות: בקבוצת הביקורת: 0.2 ±-0.3 ננוגרם/מ"ל, בקבוצת הטיפול ההורמונלי: 16 ±-5 ננוגרם/מ"ל (ממוצע ± סטיית תקן), המקביל לממד ההשפעה שנמדד עם d = 4.46 של כהן (השפעה גדולה מאוד).
      עבור מודל dMF: בעלי חיים/קבוצה n=3, על פי Gómez et al.19 המציין לאחר שבועיים של טיפול, הרמות הבאות: קבוצת ביקורת: 1.901 ± 0.413 ננוגרם/מ"ל וקבוצת טיפול הורמונלי: 0.043 ±-0.023 ננוגרם/מ"ל (ממוצע ± שגיאת תקן) התואם לממד השפעה שנמדד עם d = 6.35 של כהן (השפעה גדולה מאוד).
    2. כדי ליישר את שני המודלים, בחרו n=4 חיות לכל מין/קבוצה, ובסך הכל N = 32 חיות.
  3. לאחר שבוע אחד של התאקלמות, חלקו את החולדות לפי מין לשתי קבוצות ניסוי (dMF ו-dFM, 4 חולדות לקבוצה), כל אחת מורכבת מ-C אחד (זכר ביקורת, CM ונקבת ביקורת, CF) ושלוש קבוצות טיפול של GAHT שנבחר.
  4. עקוב אחר כל החולדות פעמיים ביום (בשעות 8:30 בבוקר ו-4:00 אחר הצהריים) כדי לבדוק מצבים בריאותיים כלליים ואגרסיביות פוטנציאלית עקב מתן GAHT. רשום את משקל הגוף (bw) וצריכת המזון פעמיים בשבוע, תוך שימוש באיזון אנליטי עם פונקציית שקלול דינמית אופטימלית למשקל חיות מעבדה.
  5. במודל הניסוי dFM, מדדו את קוטר הדגדגן של כל החולדות מיד לפני תחילת הטיפול (נקודה 0) ובסוף הטיפול (נקודה 13), באמצעות מד דיגיטלי לקריאות מדויקות.
  6. שקלו את כל בעלי החיים לפני ההקרבה, ובמודל dMF, מיד לאחר ההקרבה הסירו את האפידידימיס על מנת לבצע את ספירת הזרע.

2. בחירת מינון והכנה

  1. השתמש בשלוש המנות הבאות של הורמונים שיינתנו לחולדות dFM: 5, 10.5 ו-22.5 מ"ג/ק"ג לשבוע, עבור מודל dMF, השתמש בשלוש רמות המינון הנבחרות הבאות (DL): DL1 E2 0.045 מ"ג/ק"ג + CPA 0.2 מ"ג/ק"ג, DL2 E2 0.09 מ"ג/ק"ג + CPA 0.2 מ"ג/ק"ג ו-DL3 E2 0.18 מ"ג/ק"ג + CPA 0.2 מ"ג/ק"ג.
    הערה: כל המינונים נבחרים תוך התחשבות בהנחיות הקליניות האנושיות העיקריות המשמשות לאנשים TG15 והנתונים המוגבלים הזמינים בספרות.
  2. הכן את כל פתרונות המלאי מדי שבוע באמצעות מכסה מנוע בטיחות כימי. מערבבים כראוי את כל החומרים לשמן השומשום כרכב, ומבטיחים את המסתם המלאה.
    הערה: עבור שני הדגמים, השתמש במחשבון המרת מינון (https://dosecal.cftri.res.in/) כדי להזין את המינון להמרה, המין שעבורו נקבע המינון, מין בעלי החיים והמשקל שעבורו יש להמיר את המינון. עבור מודל dFM (טבלה 3), טיפול הורמונלי אנושי, מינון מקסימלי של 100 מ"ג T לשבוע20. המינון המחושב בחולדות הוא 10.5 מ"ג/ק"ג T לשבוע. המנה השנייה היא 22.5 מ"ג/ק"ג לשבוע בחולדות18. המנה השלישית היא 5 מ"ג/ק"ג לשבוע, המזוהה על ידי שמירה על גורם של 2.1 בין שתי המנות המחושבות. עבור מודל dMF ראה טבלה 4, המינונים מבוססים על משטרים מומלצים לבני אדם21 ונתונים זמינים באמצעות מחקרי in vivo 14,19,22.

3. טיפול בבעלי חיים

  1. בצע מתן תת עורי של T (לדגם dFM) ו- E2 פלוס CPA (לדגם dMF) על ידי צביטה והרמה של העור במקום ההזרקה, ויוצר מעין וילון. לאחר מכן, הכנס את המחט של מזרק 1 מ"ל במקביל לגב החיה. לאחר שנכנס פנימה, הזריק לאט את הנפח הנדרש (100 מיקרוליטר עבור T; 200 מיקרוליטר עבור E2+CPA)23.
    1. התייחסו לבעלי החיים באופן הבא: עבור מודל dFM, יש לתת T אננטט מומס בשמן שומשום (רכב) פעמיים בשבוע למשך שבועיים (100 מיקרוליטר לכל הזרקה תת עורית של T). עבור דגם dMF, יש לתת E2 בתוספת אצטט CPA מומס בשמן שומשום (רכב) 5 פעמים בשבוע למשך שבועיים (200 מיקרוליטר לכל זריקה תת עורית). טפל בחולדות מקבוצת C באותו אופן עם הרכב בלבד (שמן שומשום).

4. דגימת דם, הקרבה ודגימת רקמות

  1. לאחר שבועיים של טיפול, ממש לפני ההקרבה, השתמש במערכת הרדמה גזית והרדים את כל בעלי החיים. לגרום להרדמה במינון המשתנה בין 2% ל-3.5% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב של 1.5 ליטר לדקה עד לאובדן הרפלקסים בתא אינדוקציה שקוף מפוליסטירן. הנח את החולדה במצב שכיבה על כרית החימום והסדיר את מינון האיזופלורן במינון תחזוקה המשתנה בין 1.5% ל-3.5% הניתן על ידי מסכת אף עכברוש רגילה לאורך כל הליך דגימת הדם התוך לבבית.
  2. הכינו מזרק של 5 מ"ל עם מחט 21 גרם, ובטלו את הוואקום. בוחן את הלב באצבעות, הכנס בזהירות את המחט לדופן בית החזה הצדדית בניצב לגוף בערך בנקודת המרפקים המכופפים, בין צלעות 5 ו -6. ברגע שנכנס לחדר הלב, הדם נכנס למזרק על ידי נימיות. משוך את בוכנת המזרק לאט וברציפות עד לשאיבת דם.
  3. לאחר דגימת הדם, הכניסו את החולדות לתא CO2 על מנת לבצע המתת חסד באמצעות חנק CO2 עם קצב מילוי של 30%-70% תזוזה של נפח התא לדקה. לאחר 2-3 דקות, ודא את מותם של בעלי החיים על ידי ניטור הנשימה וקצב הלב24.
  4. לאחר הקרבן, הניחו כל בעל חיים על שולחן הנתיחה בשכיבה, כשהרגליים הקדמיות פונות כלפי מעלה והרגליים האחוריות כלפי מטה, וקבעו אותן בעזרת סיכות. מפזרים את בטן החיה בתמיסת חיטוי.
  5. כרתו את האיברים הבאים: אשכים, אפידידימיס, רחם, שחלות, כבד ובלוטת התריס. שקלו ואחסנו אותם בצינורות של 50 מ"ל עם 35 מ"ל של פורמלין 10% בופר (כל האיברים) או תמיסת בואין (אשכים בלבד) או אספו אותם בצינורות קריוגניים (איבר/צינור) והקפיאו אותם מיד בחנקן נוזלי (לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס).
    1. ראשית, חותכים את העור במספריים בקו האמצע, מהערווה ועד הבטן העליונה. בצע שני חתכים רוחביים בכלוב הצלעות והשקף את העור משני צידי החתך כדי לחשוף את קרביים בית החזה.
    2. הסר תחילה את איברי הרבייה; בחולדות זכרים, הסר את האשכים, איברים זוגיים בצורת אליפסה הממוקמים בחלל הבטן, במצב התוך בטני (שק האשכים). חותכים ולוחצים על שק האשכים כדי לוודא שהאשכים בולטים החוצה, ואז אחוזים בהם בעדינות. החזיקו את השומן הקרביים בעזרת צבת, ואז חתכו את האשכים מהקרביים. לאחר הכריתה, שקלו ואחסנו את האשכים בתמיסה של בואן לניתוח היסטופתולוגי.
    3. בחולדות נקבות, תחילה תפסו את הרחם בעדינות, ואז חתכו את השחלות (הממוקמות בקצה שתי קרני הרחם) מרקמת השומן הקרביים. לאחר הכריתה יש לשקול את השחלות.
    4. בחולדות נקבות וזכרים כאחד, עברו לצד הימני של חלל הבטן, שם נמצא הכבד. הכבד הוא איבר רב-אוני וניתן לזהות חלקים רבים: מדיאלי שמאלי (קטן יותר), שמאלי לרוחב (מז'ור), מדיאלי ימני (קטן יותר), לרוחב ימני (מז'ור), זנב ואונה מרובעת25. תפסו את הכבד בעזרת מלקחיים, הקפידו לא לשבור אותו. תפוס את תהליך ה- xiphoid בעזרת צבת וחתוך לחלוטין את הסרעפת במספריים.
    5. השתמש במלקחיים כדי להרים את תהליך ה-xiphoid ולחלץ את הכבד מחלל הבטן. הפרד את הכבד מהסרעפת בעזרת מספריים. לאחר מכן, שקלו את הכבד ואחסנו.
    6. למיצוי בלוטת התריס, בעזרת מספריים, חותכים בניצב לאורך צוואר החיה, מסירים את העור והשרירים, וחותכים בעדינות את קצות קנה הנשימה, בהם נמצאת בלוטת התריס. אחסן את בלוטת התריס לניתוח נוסף26.
  6. בצע ספירת זרע כמתואר להלן.
    1. לאחר הסרת האשכים, תפוס את האפידידימיס, המחובר לשוליים האחוריים של האשך המתאים וכלול בשק האשכים.
    2. בניסוי זה נלקחות דגימות זרע מזנב האפידידימיס הימני. בזמן האיסוף יש לנקות את הזנב משומן ורקמת חיבור בעזרת מספריים, להפריד אותו מהחלק הנותר ולהניח אותו בצלחת פטרי (35 מ"מ על 10 מ"מ) המכילה 1 מ"ל DMEM. חותכים במספריים וזורמים עם פיפטה פסטר כדי להקל על שחרור התוכן.
    3. העבירו את כל הנוזל המתקבל לצינור של 15 מ"ל והביאו את הנפח ל-10 מ"ל עם DMEM (גורם דילול 1:10=0.1). פיפטה את התוכן להומוגניזציה ויצירת השעיה. לאחר טלטול קל, קח 10 מיקרוליטר מהמתלה כדי להעמיס את תא נויבאואר. טען את המצלמה ולאחר 3 דקות של טעינת המצלמה, התחל בספירה.

5. בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA).

  1. אספו דגימות דם (כ-2-5 מ"ל לבעל חיים) בצינורות של 2 מ"ל ואפשרו להם להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעה. סובב את כל דגימות הדם בצנטריפוגה פעמיים למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ו-3000 x גרם.
  2. לדם צנטריפוגה מראה רב שכבתי עם שלוש שכבות בצבעים שונים. השכבה העליונה מורכבת מפלזמה (בדרך כלל צהובה או שקופה), החלק הנוזלי של הדם; השכבה שמתחת לפלזמה עשויה להיות בעלת צבע לבנבן או אפור והיא מעיל באפי. השכבה התחתונה מכילה כדוריות דם אדומות, והצבע עשוי להופיע אדום כהה או אדום בוהק. כדי לקבוע את רמות הורמוני המין, אספו את הסרום של כל הדגימות בעזרת פיפטה (מבלי לגעת במעיל הבאפי או בשכבות האריתרוציטים), חלקו אותן לאליקוטים (500 מיקרוליטר) ואחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. בשני המודלים, בצע בדיקת ELISA כדי לזהות ו/או למדוד נוכחות של חלבונים, נוגדנים או אנטיגנים בדגימה לקביעת הורמוני המין. השתמש בשיטה הישירה ופעל לפי ההוראות של כל ערכת ELISA. במחקר זה נקבעו רמות הסרום של ההורמונים הבאים בחולדות: E2, עכברוש אסטרדיול ELISA; T, טסטוסטרון עכבר/עכברוש אליסה; TSH, ערכת אליסה עכברוש ו-T4, ערכת אליסה עכברוש.

6. ניתוח היסטופתולוגי

  1. הכן שקופיות היסטולוגיות של רקמות על פי ההליכים הבאים.
  2. יש לתקן את דגימות הרחם, השחלה, בלוטת התריס והכבד בזמן העקירה בפורמלין חומצי של 10% למשך 48 שעות לפחות.
    זהירות: יש לעבוד מתחת למכסה מנוע כימי. אין לשאוף את החומר/התערובת. הימנע מיצירת אדים/אירוסולים.
  3. שטפו דגימות מתחת למים זורמים למשך שעה אחת ולאחר מכן אחסנו ב-80% אלכוהול אתילי (C2H5OH) עד לעיבוד, כדי לשמר את המבנה הפרוטופלזמי משינויים הנובעים ממוות תאי.
  4. תקן את האשך בתמיסה של Bouin המורכבת מ-15 מ"ל של תמיסה רוויה של חומצה פיקרית, 5 מ"ל של פורמלין מרוכז (33%-40%), ו-1 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית למשך 48 שעות. שטפו דגימות עם 80% אלכוהול אתילי.
    זהירות: יש לעבוד מתחת למכסה מנוע כימי.
  5. בצע הכללה בפרפין מוצק באמצעות מעבד רקמות אוטומטי. בתום תהליך ההכללה, הניחו את הדגימות במכלי מתכת קטנים בהם נשפך פרפין מומס ומצננים על צלחת קפואה, ויוצרים את הבלוקים לחיתוך. כוון אותם בהתאם לקטע החיתוך הרצוי.
  6. לאחר מכן, חותכים את הדגימות באמצעות מיקרוטום מסתובב. אוספים מקטעים של 5-6 מיקרומטר בעזרת מברשות קטנות, מורחים אותם למים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר שניות, ומניחים אותם על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ. השאירו את השקופיות להתנקז בניצב למספר דקות וייבשו אותן בתנור בחום של 36 מעלות למשך שעה לפחות.
  7. בצע צביעת המטוקסילין ואאוזין כמתואר להלן.
    1. הפזר את השקופיות על ידי טבילתן בחומר ניקוי ממקור טרפן (תחליף קסילן) למשך 5 דקות.
    2. החזר את השקופיות על ידי טבילתן בסדרה הבאה של אתנול מדורג. לכל תמיסה, 2 דקות לטבילה: 100% אתנול, 95% אתנול, 80% אתנול, 50% אתנול ומים מזוקקים.
      הערה: זה יכול להיות נקודת עצירה לפרוטוקול, וניתן להשאיר את המגלשות ב-RT במים למשך מספר שעות. לחלופין, ניתן לאחסן את המגלשות גם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במים.
    3. מניחים את השקופיות בהמטוקסילין של מאייר למשך 5 דקות. העבירו אותם מיד למיכל עם מי ברז למשך 5 דקות. העבירו מי ברז לפינה האחורית של המיכל הרחוק ביותר מהחלקים. רוקן מעת לעת את המיכל עד שהצבע הסגול במים כבר לא קיים.
      הערה: כדי למנוע קילוף של חלקים מהמגלשות, אין להזרים מים ישירות על המגלשות.
    4. הנח את השקופיות בתמיסה מימית של eosin Y 1% למשך 2 דקות. מעבירים את המגלשות למים מזוקקים למשך 15 שניות. ייבש את המגלשות על ידי טבילתן בסדרה הבאה של אתנול מדורג. לכל תמיסה, 15 שניות לטבילה: 50% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול.
    5. מניחים את השקופיות ב-100% אתנול למשך דקה אחת ומחליפים אותו לאתנול 100% טרי למשך דקה נוספת. הנח את השקופיות בחומר ניקוי ממקור טרפן (תחליף קסילן) למשך 2 דקות ושנה אותו לחומר ניקוי טרי ממקור טרפן (תחליף קסילן) למשך 2 דקות נוספות. הסר שקופית אחת בכל פעם והנח כיסוי.
    6. מכסים את החלקים במדיום הרכבה ומניחים כיסוי בתחתית השקופית.
      הערה: ודא שאמצעי ההרכבה מושך את השקופית למקומה. אם הכיסוי אינו שטוח, הקש אותו בעדינות למקומו. כתם כל אמצעי הרכבה עודף באמצעות מגבת נייר.
    7. טבלו מגבון ניקוי בחומר הניקוי ממקור טרפן (תחליף קסילן) ונגבו את החלק האחורי של השקופית כדי להסיר כל מדיום מטפטף. הנח את השקופית שטוחה על משטח מוצק נייד, כמו חתיכת קרטון. הוסף תלוש כיסוי לכל השקופיות הנותרות כמתואר בשלב 6.7.6. הניחו למגלשות להתייבש ולמדיום ההרכבה להתקשות ב-RT במכסה המנוע.
      זהירות: יש לעבוד מתחת למכסה מנוע כימי.
  8. לאחר הצביעה, כסו את הדגימות בתלוש כיסוי והעריכו אותן באמצעות מיקרוסקופ אופטי. שינויים היסטופתולוגיים תוארו על סמך תפוצה, חומרה ומאפיינים מורפולוגיים.
  9. בצע ניקוד פציעה באופן חצי כמותי, תוך שימוש בסולם הערכה של 5 נקודות (0 עד 4), בהתחשב בחומרת השינויים על סמך קריטריונים שהוסברו על ידי שקלפורד ואחרים.27 וסיכום כדלקמן:
    ציון 0: ללא שינוי
    כיתה 1: מינימום שינוי. ההשפעה בקושי נראית על הרקמה; קטן ונדיר. משפיע על חלק מהרקמה הקטן או שווה ל-10%.
    כיתה ב': שינוי אור. מייצג שינוי היסטולוגי קטן. ציון זה משמש כאשר הרקמה, או המבנה שלה, הראו שינוי בנפח בין 11% ל-20%.
    כיתה ג': שינוי מתון. השינוי ניכר ברקמה. הדרגה מצביעה על נוכחות של וריאציות בין 21%-40% מהרקמה או המבנה שלה
    כיתה ד': שינוי ניכר. שינוי היסטולוגי מכריע של הרקמה או המבנה שלה. וריאציות משפיעות על 41%-100% מהרקמה.
  10. בצע ניתוח היסטומורפומטרי כמותי על הרחם, השחלה, האשכים ובלוטת התריס. בחן קטעי רקמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה המופעלת על מיקרוסקופ אופטי ובצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. רחם: באמצעות מטרה של 2x למדוד את השטח הכולל של כל קטע רוחבי של קרן הרחם הימנית, את השריר החיצוני והפנימי ואת לומן הרחם. חשב את שטח רירית הרחם והשריר ואת היחס בין שטח רירית הרחם לשריר הרחם28.
    2. שחלה: השתמש באחד החתכים השלמים במיקום המרכזי של השחלה כדי לחשוף זקיקים בשלבי התפתחות שונים; ספרו את הזקיקים הראשוניים, המשניים, הקורפוס הצהוב, הגראף והאטרזי באמצעות מטרה פי 4. בצע סיווג של זקיקים לפי Fortune29. בנוסף, יש למדוד את שטח השחלה עבור כל דגימה ואת צפיפות הזקיקים שלה (מספר הזקיקים/שטח השחלה x 100)30.
    3. אשך: באמצעות יעד 10x, למדוד 20 צינוריות / דגימה; בנוסף, מדוד את שטח הלומן הכולל, השטח הכולל, קוטר האורך והקוטר הרוחבי28.
    4. בלוטת התריס: מדוד את הפרמטרים הבאים: צפיפות זקיקים (יחס בין מספר הזקיקים לאזור נתון, פי 10 מטרה); גובה תא זקיקי עקיף (יחס ממוצע של שטח הזקיק ושטח הקולואיד בחמישה זקיקים שנבחרו באקראי / דגימה 40x מטרה); היחס הממוצע בין שטחי האפיתל הזקיקי ומספר הגרעינים (באותו זקיק כדי לוודא את התבגרות הזקיקים); גובה תא זקיקי (ממוצע של גובה חמישה תאים בחמישה זקיקים/דגימה שנבחרו באופן אקראי, אובייקטיבי פי 64)31.

7. ביטוי גנים

  1. עבור שני המודלים, בצע את ניתוח ביטוי הגנים באמצעות דגימות כבד המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הפרוטוקול של טיהור RNA כולל באמצעות ערכה, החל מליזאט של רקמת בעלי חיים.
    1. כדי להשיג את ליזט הכבד, טוחנים את דגימת הרקמה (10 מ"ג) עם מיניפינר, מוסיפים 600 מיקרוליטר של RL BUFFER (מסופק עם הערכה) לדגימת הרקמה, וממשיכים לטחון עד שהדגימה הומוגנית.
  2. מיד לאחר המיצוי, כמת את ה-RNA שהתקבל והעריך את איכותו (לדנטורציה או נוכחות של שאריות חלבון כלשהן) באמצעות פלואורוספקטרומטר. בצע קריאות ספיגה ספקטרופוטומטריות באורכי גל של 260 ננומטר ו-280 ננומטר, כאשר חומצות גרעין וחלבונים נספגים בהתאמה.
  3. לאחר הערכת ריכוז ה-RNA הכולל, באמצעות ערכת סינתזה של cDNA בהתאם להוראות היצרן, תמלל לאחור את הנפח המתאים המכיל 1 מיקרוגרם של RNA כולל מכל דגימה ל-cDNA.
  4. נתח את ה-cDNA שהושג על ידי RT-PCR.
    1. כדי לנתח ביטויי גנים של גנים מעניינים, תוכננו פריימרים ספציפיים קדימה ואחורה עבור כל גן מטרה, כמו גם עבור גן הייחוס המתבטא באופן מכונן גליצרלדהיד פוספט דהידרוגנאז (GAPDH). השתמש ביישום האינטרנט Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) כדי לבחור את הפריימרים הטובים ביותר שיבטיחו את הספציפיות של הזיווג רק לגן המעניין ולהשיג את האוליגונוקלאוטידים המסונתזים על ידי ספק מסחרי. הרצפים של זוגות הפריימרים המשומשים מדווחים בטבלה 5.
    2. השעו מחדש את הפריימרים הליופיליים במים מזוקקים ללא RNAse בריכוז סופי של 100 מ"מ. השתמש בערכה ייעודית לביצוע ניתוח qPCR. בצע את התגובות בנפח סופי של 20 מיקרוליטר, תוך דילול ה- cDNA המחושל 1:40. טען כל דגימה בשכפול בלוחות PCR של 96 בארות.
    3. בצע ריצות qPCR על מחזור תרמי בעקבות תוכנית זו: מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה. בסוף, בצע מחזור דיסוציאציה מ-55 מעלות צלזיוס ל-95 מעלות צלזיוס (30 שניות/מעלות צלזיוס) כדי לאמת את הספציפיות של המוצר המוגבר. באמצעות התוכנה הייעודית של המכונה, השג ערכי מחזור סף (סף מחזור, Ct) עבור כל דגימה. בטא את התוצאות כ- ΔΔ Ct (דלתא דלתא Ct) על פי נוסחת Pfaffl32:
      גן יעד ΔCt = בקרת Ct - מטופל ב-Ct
      גן ייחוס ΔCt = בקרת Ct - מטופל ב-Ct
      ΔCt = גן יעד ΔCt - גן ייחוס ΔCt

8. ניתוח נתונים

  1. ביצוע ניהול נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני. לבצע אנליזה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. עצבו גרפיקה באמצעות תוכנה ייעודית.
  2. מייצגים עלייה במשקל גוף, צריכת מזון, משקל איברים מוחלט ויחסי, רמות הורמונים בסרום, נתונים מורפומטריים של רקמות ונתוני ביטוי גנים כממוצע ± סטיית תקן. בצע ניתוח קרוסקאל-וואליס לא פרמטרי, ואחריו השוואות זוגיות פוסט-הוק (מבחן מאן-וויטני).
  3. לנתח נתונים היסטולוגיים באמצעות מבחן פישר מדויק דו-כיווני כדי לזהות הבדלים משמעותיים מקבוצת הביקורת, כולל דגימות המוקצות לקטגוריה ללא כל התייחסות לדרגות חומרה (שכיחות ממצא כוללת). השתמש במבחן מגמת Cochran-Armitage כדי לזהות את מגמת התגובה למינון. קחו בחשבון את ההבדלים בין הקבוצות כמשמעותיים אם ערך ה-p הוא <-0.05.

תוצאות

כפי שהודגם על ידי Tassinari et al.14 ועל ידי Tammaro et al.33, התוצאות הבאות הראו את ההצלחה של GAHT על חולדות ואת ההתאמה של המודלים.

לא נרשמו תמותה או התנהגות חריגה, כגון תוקפנות, ולא נצפים סימנים קליניים של רעילות או סבל (למשל, ירידה בפעילות, פילוזק?...

Discussion

יישום מודלים של מכרסמים המחקים GAHT הוא חיוני לחקר הרגישות והפגיעות הספציפית הפוטנציאלית של אנשים TG והתוצאות ארוכות הטווח של הטיפולים, הנמשכים בדרך כלל כל חייהם.

בהתחשב במספר המועט של מחקרים דומים בספרות, הנקודה הקריטית של ניסוי זה היא בחירת המינונים לקביע...

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים ליצור ניגוד עניינים.

Acknowledgements

ללא.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytical balance ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuge 5415 REppendorfFor eppendorf
Cyproterone AcetateSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism software version 5.0  for WindowsGraphPad Software
HematoxylinBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Imaging SoftwareNikonNIS-BR
JMP 10 statistical softwareSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopyNikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Portable Balances SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesDesigned by PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
SensiFASTcDNA Synthesis KitBiolineBIO-6505350 reaction
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley rats male and femaleEnvigo8/9 weeks old
Standard dietsMucedola4RF18
T4(Thyroxine) ELISA KitELK BiotechnologyELK871696T
Testosterone enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Tissue processorShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KITNorgen1720050 column
Victor 3 Multilabel reader Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631

References

  1. Rokach, A., Patel, K. . Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. . Gender Dysphoria. , (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343 (2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877 (2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. &. #. 8. 2. 1. 7. ;., Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640 (2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. . Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002 (2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474 (2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839 (2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716 (2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5 (2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013 (2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GAHTTGdMFdFMCYP450

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved