将 CRISPR/Cas9 技术与细胞计数相结合评估造血干细胞和祖细胞生长相关基因的异常

摘要

在这里，我们提出了一种方案，该方案将 CRISPR/Cas9 技术与细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定相结合，以鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。

摘要

造血干细胞具有长期自我更新的能力，并有可能分化成各种类型的成熟血细胞。然而，造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 中癌变突变的积累可以阻断正常分化，诱导异常增殖，并最终导致白血病生成。为了识别和/或评估癌变突变，我们将 CRISPR/Cas9 技术与细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定相结合，以研究模型基因 Trp53，该基因对 HSPCs 的异常增殖能力至关重要。具体来说，收获来自 Cas9 小鼠富含 HSPCs 的骨髓细胞，然后用靶向一个或多个候选基因的单向导 RNA （sgRNA） 进行病毒转染，以在 HSPC 中引入遗传改变。然后，进行 CCK-8 检测以研究转染 HSPCs 的增殖能力。通过分解法追踪插入缺失来确认 sgRNA 靶向效率。这些已鉴定的基因可能在白血病发生中起关键作用，并可能作为潜在的治疗靶点。

引言

造血作用在一生中产生所有血细胞谱系，由称为造血干细胞 （HSC） 的小群体维持。HSC 通过自我更新来维持自身，并产生各种定型祖细胞，从而产生完全分化的功能性血细胞 ^1,2,3。这个过程受到严格监管。然而，造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 中癌变突变的积累会阻碍正常分化，赋予异常的增殖能力，并最终将 HSPC 转化为白血病起始细胞 （LIC）4,5,6,7。识别和确认白血病突变仍然是癌症研究的一大挑战。

最近，成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9 （Cas9） 系统已经开发出来，并成为一种高效且精确的基因编辑方法，由 Cas9 核酸酶和单向导 RNA （sgRNA^{） 组成}8。sgRNA 通过 RNA-DNA 互补性将 Cas9-sgRNA 复合物引导至特定的基因组位置，其中 Cas9 核酸酶诱导双链断裂。断裂的 DNA 受到内源性基因编辑机制的影响，要么在同源模板存在下通过精确的同源定向修复，要么通过易错配的、非同源的末端连接，从而导致小的插入或缺失⁹。目前，CRISPR/Cas9 系统已成为靶向基因编辑和转录调控的有力工具¹⁰。

在这里，我们利用 CRISPR/Cas9 技术在 HSPCs 中引入遗传改变，然后进行细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定，以研究引入的突变是否对 HSPCs 的异常增殖至关重要。具体来说，从 Cas9 小鼠中收获富含 HSPCs 的骨髓细胞，然后用靶向候选基因的 sgRNA 进行病毒转染。然后，进行 CCK-8 检测以确定突变是否赋予转染 HSPC 增加的增殖能力。最后，通过分解追踪插入缺失 （TIDE） ¹¹ 或靶向深度序列¹² 证实 CRISPR/Cas9 引入的突变。该方案为评估癌变突变和白血病的潜在治疗靶点提供了强大的工具。

研究方案

根据该方案进行的所有动物实验均已获得北京中医药大学动物护理与福利委员会的批准。

1. 构建靶向候选基因的 sgRNA 质粒（4 - 5 天）

1. 使用在线 sgRNA 设计工具设计靶向 sgRNA。将目标基因组 DNA 序列输入在线 sgRNA 设计工具（例如，https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）。选择合适的 sgRNA 靶标并订购必要的寡核苷酸。
2. 准备 sgRNA 寡核苷酸插入片段。重悬每个 sgRNA 的设计寡核苷酸的顶部和底部链（步骤 1.1）至终浓度为 100 μM。根据 表 1 准备混合物以磷酸化和退火 sgRNA 寡核苷酸。使用以下热循环参数：37 °C 30 分钟;95 °C 5 分钟;在 5 °C ^min-1 下下降至 25 °C。
3. 将 1 μL 磷酸化和退火寡核苷酸加入 199 μL 室温 ddH₂O 中，以达到 1：200 的稀释比例。
4. 线性化载体质粒。
   1. 使用引用的主链载体（参见 材料表），使用限制性内切酶 Esp3I （BsmBI） 消化载体质粒。根据 表 1 设置反应并在 55 °C 下孵育 1 小时。
   2. 将 0.5 μL 虾碱性磷酸酶 （rSAP） 添加到同一管中，并在 37 °C 下孵育 30 分钟，以降低线性质粒自动偶联的可能性。
   3. 检查线性化是否成功。将线性化质粒和未切割的质粒加载到 0.8-1% （w/v） 琼脂糖凝胶上进行电泳。
   4. 用 PCR 纯化试剂盒纯化线性化质粒，在 20 μL ddH₂O 中洗脱，并定量 DNA 浓度。
5. 根据 表 1 设置每个 sgRNA 的连接反应，将 sgRNA 寡核苷酸克隆到载体质粒中。在 16 °C 下孵育 4 小时。
6. 对于转化，将 10 μL 步骤 1.5 中的产物添加到 50 μL 冰冷感受态 Stbl3 细胞中，将混合物在冰上孵育 30 分钟，在 42 °C 下热休克 90 秒，然后立即将其放回冰中 2 分钟。将 200 μL 不含抗生素的 LB 培养基添加到同一管中，在 37 °C 下以 220 rpm 摇动 30 分钟，然后将其接种到含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 板上。将板在 37 °C 下孵育过夜。
7. 第二天，检查平板是否有菌落生长。从每个板中选择 6-8 个菌落，并使用菌落 PCR 检查 sgRNA 是否正确插入。选择阳性菌落，并使用无菌移液器吸头将单个菌落接种到 5 mL 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中。将培养物在 37 °C 下孵育并摇动过夜。
8. 使用小型质粒 DNA 纯化试剂盒从培养物中分离质粒 DNA。从 U6 启动子进行测序，以确保正确插入 20-nt 引导序列。

2. 慢病毒包装（2 - 3 天）

1. 在补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS） 和 1% （v/v） 青霉素-链霉素溶液的 DMEM 培养基中培养 HEK 293T 细胞，浓度为 37 °C 和 5% CO₂。
2. 通过从培养皿中吸出旧培养基来传代HEK293T细胞，并用 3 mL PBS 轻轻洗涤培养皿 2 次。将 1 mL 胰蛋白酶加入 10 cm 培养皿中，并在 37 °C 下孵育 1 分钟。向培养皿中加入 3 mL 温热的 DMEM 培养基以灭活胰蛋白酶，将细胞收集到 15 mL 试管中，并以 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 5 mL 培养基中，然后根据需要将细胞接种到新培养皿中。
   注：使用传代次数少于 10 代的 HEK 293T 细胞进行慢病毒生产。
3. 转染前 16 至 24 小时，将HEK293T细胞以 2-4 × 10⁶ 个细胞的密度接种到 10 cm 培养皿中。确保使用的 DMEM 不含抗生素。
4. 确保细胞在转染当天达到 70-80% 汇合。每 10 cm 培养皿转化 10-15 μg 质粒，并保持质粒与 PEI 的摩尔比为 1：3。根据 表 2 制备用于转染的混合物 1 和混合物 2。
5. 将混合物 2 静置 5 分钟。将混合物 2 加入混合物 1 中（注意不要颠倒添加顺序），充分混合，然后静置 15-20 分钟。
6. 将复合物（步骤 2.5）添加到细胞中，轻轻摇动培养皿混合，然后在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育。6 到 8 小时后，用 DMEM 培养基（含有 10% FBS）替换培养基。
7. 慢病毒转染开始两天后，从培养皿中汇集慢病毒上清液。在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 10 分钟，并通过 0.45 μm 微滤膜过滤。分配慢病毒并储存在 -80 °C。
   注意：收集的慢病毒可以根据需要浓缩。避免因反复冻融而降低病毒滴度。

3. 骨髓细胞提取和培养（12 - 13 天）

注：所有小鼠系均维持在纯 C57BL/6 遗传背景中。LSL-Cas9 小鼠 （T002249） 与 Mx1-Cre 小鼠¹³ 杂交生成 LSL-Cas9/+;Mx1-Cre/+ 小鼠。在这里，我们从 Mx1-Cre/+ 收集骨髓细胞;LSL-Cas9/+ 小鼠及其同窝小鼠。

1. 为了诱导 Cre 重组酶的表达，在第 1 天和第 3 天腹膜内注射小鼠（8-12 周龄）150 μL 聚肌苷 - 聚胞苷酸 （1.5 mg/mL）。第 6 天，用 5-氟尿嘧啶 （5-FU，150 mg/kg） 腹膜内注射小鼠。
   注：Mx1-Cre 转基因小鼠经过工程改造，可在诱导型 Mx1 启动子¹³ 的控制下表达 Cre 重组酶。腹腔注射聚肌苷-多胞苷可有效激活 Mx1 启动子并诱导 Cre 重组酶表达¹⁴。注射 5-FU 用于消耗骨髓中增殖的细胞，从而诱导 HSC 进入细胞周期并导致 HSPC 的相对丰度¹⁵。在 5-FU 处理后，每只小鼠可以收获大约 2-4 × 10⁶ 个骨髓细胞。
2. 在第 11 天，通过 CO₂ 窒息处死小鼠。取小鼠的股骨和胫骨，使用 1 mL 无菌注射器用含有 2% FBS 的 PBS 冲洗骨髓腔，并按照 Gavrilescu 等人 ¹⁶ 的描述收集骨髓细胞。
   注意：从小鼠中取出胫骨和腓骨后立即将骨骼转移到层流罩中，以在骨髓细胞收集过程中保持无菌。
3. 上下吹打骨髓细胞 （30-50x） 以将它们分散成单个细胞，然后将细胞混合物转移到 50 mL 试管中，涡旋混合均匀。
4. 将 10 μL 细胞悬液添加到 40 μL 红细胞裂解缓冲液中，并将其置于冰上 5 分钟，让红细胞裂解。加入 50 μL 台盼蓝溶液，充分混合，对活细胞进行计数。
5. 将细胞在 4 °C 下以 800 × g 离心 15 分钟。 吸出上清液。
6. 如表 3 所述，在骨髓预刺激培养基中以 1-2 ×^{10 6} 个细胞/mL 的比例重悬细胞。将细胞接种在 10 cm 培养皿中，10 mL/板，并孵育 24 小时。

4. 骨髓细胞的慢病毒转染（2 - 3 天）

1. 第二天，从预先刺激的平板中收集细胞。用 5 --10 mL 含 2% FBS 的 PBS 剧烈冲洗板。如步骤 3.4 所述，通过添加台盼蓝对活细胞进行计数。
2. 在室温下以 800 × g 离心细胞 10 分钟。如 表 4 所述准备病毒感染溶液。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于新鲜制备的消毒溶液（∼10⁶ 个细胞/mL）中。将悬浮细胞接种到 6 孔板中，每孔 4 mL。用封口膜密封 6 孔板，并在 32 °C 下以 1,500 × g 离心板 90 分钟。
4. 离心后，用移液管轻轻重悬细胞（但不要更换培养基），然后将板在培养箱中孵育 4-6 小时。
5. 对于第一次转染，小心地从每个孔 （~3 mL） 中吸出尽可能多的上清液培养基，并加入等体积的骨髓预刺激培养基。如果在作过程中意外吸出一些细胞，请在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用少量预刺激培养基重悬细胞，然后将它们加回孔中。
6. 对于二次转染，第二天从每个孔中取出 2-3 mL 培养基，并加入等体积的新鲜解冻的逆转录病毒储备液以及适量的 HEPES 和聚凝胺，如 表 4 所述。将板以 1,500 × g 离心 90 分钟，37 °C。
7. 离心后，轻轻重悬细胞，并继续在培养箱中孵育板 4-6 小时。
8. 按照步骤 4.5 更换培养基。孵育 24 小时。

5. 进行 体外 CCK-8 检测（3 - 4 天）

1. 用力冲洗孔以收集骨髓细胞。用含有 2% FBS 的 PBS 洗涤板以获得最大数量的细胞。通过 70 μm 筛过滤细胞，并按照步骤 3.4 中的说明用台盼蓝计数活细胞。
2. 在室温下以 800 × g 离心细胞 10 分钟。
3. 用含有 10% FBS 和 mIL-3、mIL-6 （10 ng/mL）、mSCF （100 ng/mL） 的 DMEM 重悬细胞至 1 × 10⁵ 个细胞/mL。取 ~0.5-1 × 10⁶ 个细胞，并在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀储存在 -80 °C 用于基因组 DNA 提取。
4. 将细胞以每孔 1 × 10⁴ 个细胞的密度添加到 96 孔板中。每组制作六个重复孔。将 100 μL 无菌 PBS 添加到接种细胞的孔周围的一圈孔中。孵育 0、24、48 和 72 小时。
5. 在相应的时间点小心地从 96 孔板中吸出培养基。向孔中加入 110 μL 含有 1/10 体积 CCK-8 的培养基。设置一个空白组（仅培养基和 CCK-8，无细胞）。在培养箱中孵育 1 小时。
6. 使用微孔板分光光度计读取 450 nm 吸光度值。
7. 使用统计软件分析实验数据，并将实验数据表示为均值±标准差 （均值± SD）。使用独立样本 t 检验分析两组之间的差异，P < 0.05 表示差异有统计学意义。

6. 基因编辑验证（5 - 7 天）

1. 根据制造商的建议，使用基因组 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA（步骤 5.3）。
2. 设计扩增以 sgRNA 切割位点为中心的 200 至 500 bp 区域的引物（表 5）。
3. 对于 Sanger 测序，按照 表 6 中的方法准备混合物以进行 PCR。使用热循环仪扩增靶基因片段如下：95 °C 5 分钟，40 个循环（95 °C 30 秒，58 °C 30 秒，72 °C 9 秒），72 °C 10 分钟，4 °C ∞。
   注：基因编辑也可以使用下一代测序 （NGS） 进行验证，并且需要使用 NGS 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。
4. 在 TIDE 网站 （http://tide.nki.nl） 上分析 Sanger 测序结果。通过将实验组和对照组的 sgRNA 序列和测序结果输入此在线工具来计算 sgRNA 的编辑效率。
   注：使用 CRISPREsso2 （http://crispresso.pinellolab.org/submission）¹⁷ 分析 NGS 结果。从深度测序实验中以 fastq 或 fastq.gz 格式输入双端读长（两个文件）或单端读长（单个文件），以及参考序列和 sgRNA 序列。该软件将评估和量化靶向诱变。

结果

Trp53 敲除对小鼠 HSPC 增殖能力的影响
在这里，我们以 Trp53 敲除为例来演示该方案。为了研究 Trp53 敲除对小鼠 HSPCs 增殖能力的影响，我们采用慢病毒转染将 Trp53 sgRNA 引入 5-FU 处理后富含 HSPCs 的 Cas9 表达骨髓细胞中。同时，将无关的 sgRNAs 转染到同窝小鼠的骨髓细胞中，作为对照组。然后将转染的细胞培...

讨论

CRISPR/Cas9 技术因其用户友好性和高效率而被广泛用于生物医学研究，促进了基因功能筛选¹⁸、疾病建模¹⁹、免疫疗法²⁰ 以及活细胞标记和成像²¹ 等应用。最近的研究进行了大规模的 CRISPR 筛选，以确定包括白血病在内的各种癌症类型的新治疗靶点 22,23,24。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm microfiltration membrane	Sartoriu	16533K-1
1.5 mL EP tube	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
10 cm dish	Corning	430167
15 mL Tube	LABLEAD	LXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)	Accurate Biology	AG11010	For colony PCR
50 mL Tube	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracil	Sigma	F6627-1
6-well plate	Corning	3516
70 µm cell sieve	Falcon®	352350
96-well plates	Corning	3599
ACK Lysis Buffer	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicillin	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCR	Thermofisher
Cell Counting Kit-8	Bimake	B34304
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
Esp3I (BsmbI)	NEB	R0580L
Fetal Bovine Serum	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC;Virginia,USA
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	backbone vector
LSL-Cas9 mice	Model Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY	T002249
microplate absorbance spectrophotometer	BIO-RAD	xMark™
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Regular agarose	BIOWEST	BY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spectrophotometer	MOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cells	BioMed	BC108-01
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology	CBP50079
YEAST EXTRACT	OXOID	LP0021