Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Özet

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Özet

Hematopoetik kök hücreler, uzun süreli kendini yenileme yeteneğine ve çeşitli olgun kan hücrelerine farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC'ler) kanserli mutasyonların birikmesi normal farklılaşmayı engelleyebilir, anormal proliferasyona neden olabilir ve sonuçta lösemogeneze yol açabilir. Kanserli mutasyonları tanımlamak ve / veya değerlendirmek için, HSPC'lerin anormal proliferatif yeteneği için gerekli olan bir model gen Trp53'ü araştırmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre ettik. Spesifik olarak, Cas9 farelerinden HSPC'ler için zenginleştirilmiş kemik iliği hücreleri hasat edildi ve daha sonra HSPC'lerde genetik değişiklikler sağlamak için bir veya birkaç aday geni hedefleyen tek kılavuzlu RNA'lar (sgRNA'lar) ile viral transfeksiyona tabi tutuldu. Daha sonra, transfekte edilmiş HSPC'lerin proliferatif kapasitesini araştırmak için bir CCK-8 testi yapıldı. sgRNA hedefleme verimliliği, Ayrışma testi ile Indels İzleme ile doğrulandı. Tanımlanan bu genler lösemogenezde çok önemli roller oynayabilir ve potansiyel terapötik hedefler olarak hizmet edebilir.

Giriş

Yaşam boyunca tüm kan hücresi soylarını üreten hematopoez, hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) adı verilen küçük bir popülasyon tarafından sürdürülür. HSC'ler kendilerini yenileyerek kendilerini korurlar ve tamamen farklılaşmış fonksiyonel kan hücrelerine yol açan çeşitli kararlı progenitörler üretirler ^1,2,3. Bu süreç sıkı bir şekilde düzenlenmiştir. Bununla birlikte, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC'ler) kanserli mutasyonların birikmesi normal farklılaşmayı engeller, anormal proliferatif yetenek kazandırır ve sonuçta HSPC'leri lösemi başlatan hücrelere (LIC'ler) dönüştürür4,5,6,7. Lösemojenik mutasyonların tanımlanması ve doğrulanması, kanser araştırmaları için hala büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi geliştirilmiş ve Cas9 nükleaz ve tek kılavuzlu RNA'dan (sgRNA^{) oluşan} verimli ve hassas bir gen düzenleme yöntemi haline gelmiştir8. sgRNA, Cas9-sgRNA kompleksini, Cas9 nükleazının çift iplikli kırılmaları indüklediği RNA-DNA tamamlayıcılığı yoluyla belirli bir genomik konuma yönlendirir. Kırık DNA, ya homoloji şablonlarının varlığında hassas homolojiye yönelik onarım ya da uyumsuzluğa eğilimli, homolog olmayan uç birleştirme yoluyla endojen gen düzenleme mekanizmalarına tabi tutulur, bu da küçük eklemelere veya delesyonlara^{yol açar 9}. Şu anda, CRISPR / Cas9 sistemi, hedeflenen gen düzenleme ve transkripsiyonel düzenleme için güçlü bir araç haline gelmiştir¹⁰.

Burada, HSPC'lerde genetik değişiklikler yapmak için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullandık ve daha sonra tanıtılan mutasyonların HSPC'lerin anormal proliferasyonu için kritik olup olmadığını araştırmak için Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testini gerçekleştirdik. Spesifik olarak, HSPC'ler için zenginleştirilmiş kemik iliği hücreleri, Cas9 farelerinden toplandı ve ardından aday genleri hedefleyen sgRNA'lar ile viral transfeksiyon yapıldı. Daha sonra, mutasyonların transfekte edilmiş HSPC'lere artmış bir proliferatif yetenek kazandırıp kazandırmadığını belirlemek için CCK-8 testi yapıldı. Son olarak, CRISPR/Cas9 tarafından tanıtılan mutasyonlar, Ayrışma Yoluyla Indellerin İzlenmesi (TIDE)¹¹ veya hedeflenen derin dizi¹² ile doğrulandı. Bu protokol, kanserli mutasyonları ve lösemi için potansiyel terapötik hedefleri değerlendirmek için güçlü bir araç sağlar.

Protokol

Bu protokol kapsamında yapılan tüm hayvan deneyleri, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Aday genleri hedef alan sgRNA plazmitlerinin yapımı (4 - 5 gün)

1. Çevrimiçi sgRNA tasarım araçlarını kullanarak hedefleme sgRNA'sını tasarlayın. Hedef genomik DNA dizisini çevrimiçi bir sgRNA tasarım aracına (örneğin, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) girin. Uygun sgRNA hedeflerini seçin ve gerekli oligonükleotidleri sipariş edin.
2. sgRNA oligo eklerini hazırlayın. Her sgRNA (adım 1.1) için tasarlanan oligoların üst ve alt ipliklerini 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. sgRNA oligolarını fosforile etmek ve tavlamak için karışımları Tablo 1'e göre hazırlayın. Aşağıdaki termodöngü parametrelerini kullanın: 30 dakika boyunca 37 °C; 5 dakika boyunca 95 °C; 5 °C'de 25 °C'ye kadar rampa ^min-1.
3. 1:200'lük bir seyreltik oran elde etmek için 199 μL oda sıcaklığında ddH₂O'ya 1 μL fosforile edilmiş ve tavlanmış oligo ekleyin.
4. Vektör plazmidini doğrusallaştırın.
   1. Referans verilen omurga vektörünü kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), restriksiyon enzimi Esp3I (BsmBI) kullanarak vektör plazmidini sindirin. Reaksiyonları Tablo 1'e göre ayarlayın ve 55 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   2. Aynı tüpe 0,5 μL Karides Alkalin Fosfataz (rSAP) ekleyin ve doğrusal plazmitin otomatik konjugasyon olasılığını azaltmak için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Başarılı doğrusallaştırma olup olmadığını kontrol edin. Elektroforez için doğrusallaştırılmış plazmitleri ve kesilmemiş plazmitleri %0.8-1 (a/h) agaroz jeli üzerine yükleyin.
   4. Doğrusallaştırılmış plazmiti bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın, 20 μL ddH₂O içinde elüte edin ve DNA konsantrasyonunu ölçün.
5. Tablo 1'e göre her bir sgRNA için ligasyon reaksiyonlarını ayarlayarak sgRNA oligolarını vektör plazmidine klonlayın. 16 °C'de 4 saat inkübe edin.
6. Dönüşüm için, 1.5. adımdan itibaren 10 μL ürünü 50 μL buz gibi yetkin Stbl3 hücrelerine ekleyin, karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, 42 °C'de 90 saniye boyunca ısı şoku verin ve ardından hemen 2 dakika boyunca buza geri koyun. Aynı tüpe 200 μL antibiyotik içermeyen LB ortamı ekleyin, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 220 rpm'de çalkalayın ve ardından 100 μg / mL ampisilin içeren bir LB plakasına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
7. Ertesi gün, koloni büyümesi için plakaları inceleyin. Her plakadan 6-8 koloni seçin ve koloni PCR kullanarak sgRNA'nın doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin. Pozitif kolonileri seçin ve tek tek kolonileri steril bir pipet ucu kullanarak 100 μg/mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamına aşılayın. Kültürü gece boyunca 37 °C'de inkübe edin ve çalkalayın.
8. Bir mini plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak plazmit DNA'yı kültürlerden izole edin. 6-nt kılavuz dizisinin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için U20 promotöründen sıralayın.

2. Lentiviral paketleme (2 - 3 gün)

1. 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h) penisilin-streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş DMEM ortamında kültür HEK 293T hücreleri_.
2. Eski ortamı Petri kabından aspire ederek HEK293T hücrelerini geçirin ve kabı 3 mL PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın. 10 cm'lik bir tabağa 1 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 1 dakika inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için tabağa 3 mL ılık DMEM ortamı ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 800 × g'da döndürün. Süpernatanı atın, hücreleri 5 mL ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri gerektiği gibi yeni kaplara yerleştirin.
   NOT: Lentivirüs üretimi için 10'dan az geçişli HEK 293T hücreleri kullanın.
3. Transfeksiyondan on altı ila 24 saat önce, HEK293T hücreleri, tabak başına 2-4 × 10⁶ hücre yoğunluğunda 10 cm'lik tabaklara tohumlayın. Kullanılan DMEM'in antibiyotik içermediğinden emin olun.
4. Transfeksiyon gününde hücrelerin% 70-80 oranında birleştiğinden emin olun. 10 cm'lik tabak başına 10-15 μg plazmiti dönüştürün ve plazmitin molar oranını PEI'ye 1: 3 tutun. Karışım 1 ve Karışım 2'yi Tablo 2'ye göre transfeksiyon için hazırlayın.
5. Karışım 2'yi 5 dakika bekletin. Karışım 2'yi Karışım 1'e ekleyin (ekleme sırasını tersine çevirmemeye dikkat edin), iyice karıştırın ve ardından 15-20 dakika bekletin.
6. Kompleksi (adım 2.5) hücrelere ekleyin, karıştırmak için tabağı hafifçe çalkalayın ve 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin. Altı ila 8 saat sonra, ortamı DMEM ortamıyla (% 10 FBS içeren) değiştirin.
7. Lentiviral transfeksiyonun başlamasından iki gün sonra, lentivirüs süpernatantlarını bulaşıklardan toplayın. 4.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve 0,45 μm'lik bir mikrofiltrasyon membranından süzün. Lentivirüsü dağıtın ve -80 °C'de saklayın.
   NOT: Toplanan lentivirüs gerektiği gibi konsantre edilebilir. Tekrarlanan donma ve çözülme nedeniyle viral titreleri azaltmaktan kaçının.

3. Kemik iliği hücre ekstraksiyonu ve kültürü (12 - 13 gün)

NOT: Tüm fare hatları saf bir C57BL / 6 genetik arka planında tutulmuştur. LSL-Cas9 fareleri (T002249), LSL-Cas9/+ oluşturmak için Mx1-Cre fareleri¹³ ile çaprazlandı; Mx1-Cre/+ fareler. Burada, Mx1-Cre / + 'dan kemik iliği hücrelerini topladık; LSL-Cas9/+ fareler ve yavruları.

1. Cre rekombinaz ekspresyonunu indüklemek için, farelere (8-12 haftalık) intraperitoneal olarak 150 μL Poliinosinik-polisitidlik (1.5 mg / mL) 1. ve 3. günde enjekte edin. 6. günde, farelere intraperitoneal olarak 5-florourasil (5-FU, 150 mg / kg) enjekte edin.
   NOT: Mx1-Cre transgenik fareler, indüklenebilir Mx1 promotörü^13'ün kontrolü altında Cre rekombinazı eksprese etmek üzere tasarlanmıştır. Poliinosinik-polisitidilin intraperitoneal enjeksiyonu, Mx1 promotörünü etkili bir şekilde aktive edebilir ve Cre rekombinaz ekspresyonunu¹⁴ indükleyebilir. 5-FU enjeksiyonu, kemik iliğindeki çoğalan hücreleri tüketmek için kullanılır, böylece HSC'lerin hücre döngüsüne girmesini indükler ve göreceli bir HSPC^{bolluğu ile sonuçlanır 15}. 5-FU tedavisinden sonra fare başına yaklaşık 2-4 × 10⁶ kemik iliği hücresi toplanabilir.
2. 11. günde, fareleri CO₂ boğulması ile kurban edin. Farelerin uyluk kemiğini ve tibiasını alın, kemik iliği boşluğunu 1 mL steril şırınga kullanarak% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve Gavrilescu ve ^ark.16 tarafından tarif edildiği gibi kemik iliği hücrelerini toplayın.
   NOT: Kemik iliği hücrelerinin toplanması sırasında steriliteyi korumak için tibia ve fibula farelerden çıkarılır çıkarılmaz kemikleri laminer bir akış başlığına aktarın.
3. Kemik iliği hücrelerini tek hücrelere dağıtmak için yukarı ve aşağı (30-50x) pipetleyin, ardından hücre karışımını 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve iyice karıştırmak için girdap yapın.
4. 40 μL eritrosit lizis tamponuna 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve eritrositlerin parçalanmasını sağlamak için 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun. 50 μL tripan mavisi çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve canlı hücreleri sayın.
5. Hücreleri 800 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
6. Hücreleri, Tablo 3'te tarif edildiği gibi kemik iliği ön stimülasyon ortamında 1-2 × 10⁶ hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 cm'lik tabaklarda, 10 mL / tabakta tohumlayın ve 24 saat inkübe edin.

4. Kemik iliği hücrelerinin lentiviral transfeksiyonu (2-3 gün)

1. Ertesi gün, önceden uyarılmış plakalardan hücreleri toplayın. Plakayı% 2 FBS içeren 5 -10 mL PBS ile kuvvetlice durulayın. Adım 3.4'te açıklandığı gibi tripan mavisi ekleyerek canlı hücreleri sayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Virüs spinfection solüsyonunu Tablo 4'te anlatıldığı gibi hazırlayın.
3. Süpernatanı atın ve hücreleri taze hazırlanmış spinfection solüsyonunda (∼10⁶ hücre / mL) yeniden süspanse edin. Askıya alınmış hücreleri, oyuk başına 4 mL olmak üzere 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 6 oyuklu plakayı parafilm ile kapatın ve plakayı 32 ° C'de 90 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjleyin.
4. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir pipetle nazikçe yeniden süspanse edin (ancak ortamı değiştirmeyin), ardından plakayı bir inkübatörde 4-6 saat inkübe edin.
5. İlk transfeksiyon için, her bir oyuktan (~ 3 mL) mümkün olduğunca fazla süpernatan ortamı dikkatlice aspire edin ve eşit hacimde kemik iliği ön stimülasyon ortamı ekleyin. İşlem sırasında bazı hücreler yanlışlıkla aspire edilirse, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücreleri az miktarda ön stimülasyon ortamı ile yeniden süspanse edin ve ardından tekrar kuyuya ekleyin.
6. İkincil transfeksiyon için, ertesi gün, her bir oyuktan 2-3 mL ortam çıkarın ve Tablo 4'te tarif edildiği gibi uygun miktarlarda HEPES ve polibren ile birlikte eşit hacimde taze çözülmüş retroviral stok çözeltisi ekleyin. Plakayı 1.500 × g'da 90 dakika, 37 °C'de santrifüjleyin.
7. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin ve plakayı inkübatörde 4-6 saat inkübe etmeye devam edin.
8. Ortamı adım 4.5'teki gibi değiştirin. 24 saat kuluçkaya yatırın.

5. İn vitro CCK-8 testi yapın (3-4 gün)

1. Kemik iliği hücrelerini toplamak için kuyuları kuvvetlice durulayın. Maksimum hücre sayısını elde etmek için plakayı% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın. Hücreleri 70 μm'lik bir elekten süzün ve adım 3.4'te açıklandığı gibi tripan mavisi ile canlı hücreleri sayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
3. % 10 FBS ve% 10 FBS ve mIL-3, mIL-6 (10 ng / mL), mSCF (100 ng / mL) içeren DMEM ile hücreleri 1 × 10⁵ hücre / mL'ye yeniden süspanse edin. ~ 0.5-1 × 10⁶ hücre alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve genomik DNA ekstraksiyonu için hücre peletini -80 ° C'de saklayın.
4. Hücreleri, oyuk başına 1 × 10⁴ hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara ekleyin. Her grup için altı çoğaltma kuyusu yapın. Hücrelerin ekildiği kuyucukların etrafındaki bir kuyu çemberine 100 μL steril PBS ekleyin. 0, 24, 48 ve 72 saat kuluçkaya yatırın.
5. Ortamı, ilgili zaman noktasında 96 oyuklu plakadan dikkatlice aspire edin. Kuyucuklara 1/10 hacim CCK-8 içeren 110 μL ortam ekleyin. Boş bir grup ayarlayın (yalnızca orta ve CCK-8, hücre yok). Kuluçka makinesinde 1 saat inkübe edin.
6. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak 450 nm absorbans değerini okuyun.
7. Deneysel verileri analiz etmek için istatistiksel yazılım kullanın ve deneysel verileri ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak ifade edin. Bağımsız örneklemler t-testini kullanarak iki grup arasındaki farkları analiz edin, P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bir farkı gösterir.

6. Gen düzenleme doğrulaması (5 - 7 gün)

1. Üreticinin tavsiyelerine göre bir genomik DNA saflaştırma kiti kullanarak genomik DNA'yı (adım 5.3) çıkarın.
2. sgRNA kesim bölgesi etrafında ortalanmış 200 ila 500 bp bölgesini büyüten tasarım primerleri (Tablo 5).
3. Sanger dizilimi için, karışımı PCR için Tablo 6'daki gibi hazırlayın. Hedef gen fragmanlarını bir termosikler kullanarak aşağıdaki gibi çoğaltın: 5 dakika için 95 °C, 40 döngü (30 saniye için 95 °C, 30 saniye için 58 °C, 9 saniye için 72 °C), 10 dakika için 72 °C, 4 °C ∞.
   NOT: Gen düzenleme, yeni nesil dizileme (NGS) kullanılarak da doğrulanabilir ve PCR ürününün NGS için bir saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılması gerekir.
4. TIDE web sitesinde (http://tide.nki.nl) Sanger sıralama sonuçlarını analiz edin. Hem deney hem de kontrol gruplarından gelen sgRNA dizisini ve dizileme sonuçlarını bu çevrimiçi araca girerek sgRNA'nın düzenleme verimliliğini hesaplayın.
   NOT: CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷ kullanarak NGS sonuçlarını analiz edin. Bir referans dizisi ve bir sgRNA dizisi ile birlikte derin bir dizileme deneyinden fastq veya fastq.gz biçiminde eşleştirilmiş uçlu okumaları (iki dosya) veya tek uçlu okumaları (tek dosya) girin. Yazılım, hedeflenen mutajenezi değerlendirecek ve ölçecektir.

Sonuçlar

Trp53 nakavtının fare HSPC'lerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisi
Burada, bu protokolü göstermek için örnek olarak Trp53 knockout kullandık. Trp53 nakavtının fare HSPC'lerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisini araştırmak için, 5-FU tedavisinden sonra HSPC'ler için zenginleştirilmiş Cas9 eksprese eden kemik iliği hücrelerine Trp53 sgRNA'yı sokmak için lentiv...

Tartışmalar

CRISPR/Cas9 teknolojisi, kullanıcı dostu doğası ve yüksek verimliliği nedeniyle biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve gen fonksiyonu taraması¹⁸, hastalık modellemesi¹⁹, immünoterapi²⁰ ve canlı hücre etiketleme ve görüntüleme²¹ gibi uygulamaları kolaylaştırmaktadır. Son çalışmalar, lösemi ^22,23,24

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm microfiltration membrane	Sartoriu	16533K-1
1.5 mL EP tube	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
10 cm dish	Corning	430167
15 mL Tube	LABLEAD	LXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)	Accurate Biology	AG11010	For colony PCR
50 mL Tube	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracil	Sigma	F6627-1
6-well plate	Corning	3516
70 µm cell sieve	Falcon®	352350
96-well plates	Corning	3599
ACK Lysis Buffer	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicillin	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCR	Thermofisher
Cell Counting Kit-8	Bimake	B34304
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
Esp3I (BsmbI)	NEB	R0580L
Fetal Bovine Serum	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC;Virginia,USA
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	backbone vector
LSL-Cas9 mice	Model Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY	T002249
microplate absorbance spectrophotometer	BIO-RAD	xMark™
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Regular agarose	BIOWEST	BY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spectrophotometer	MOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cells	BioMed	BC108-01
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology	CBP50079
YEAST EXTRACT	OXOID	LP0021