JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לזהות גנים מועמדים החיוניים ליכולת ההתפשטות החריגה של תאי גזע ואב המטופויאטיים.

Abstract

לתאי גזע המטופויאטיים יש יכולת התחדשות עצמית ארוכת טווח ופוטנציאל להתמיין לסוגים שונים של תאי דם בוגרים. עם זאת, הצטברות של מוטציות סרטניות בתאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) עלולה לחסום התמיינות תקינה, לגרום להתפשטות חריגה ובסופו של דבר להוביל ללוקמוגנזה. כדי לזהות ו/או להעריך את המוטציות הסרטניות, שילבנו את טכנולוגיית CRISPR/Cas9 עם בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לחקור גן מודל Trp53, החיוני ליכולת שגשוג חריגה של HSPCs. באופן ספציפי, תאי מח עצם מועשרים ל-HSPCs מעכברי Cas9 נקצרו ולאחר מכן עברו טרנספקציה ויראלית עם RNA חד-מנחה (sgRNAs) המכוונים לגן מועמד אחד או יותר כדי להכניס שינויים גנטיים ב-HSPCs. לאחר מכן, בוצעה בדיקת CCK-8 כדי לחקור את יכולת ההתפשטות של HSPCs שעברו טרנספטציה. יעילות המיקוד של sgRNA אושרה על ידי מעקב אחר Indels על ידי בדיקת פירוק. גנים מזוהים אלה עשויים למלא תפקידים מכריעים בלוקמוגנזה ויכולים לשמש כמטרות טיפוליות פוטנציאליות.

Introduction

המטופואיזה, המייצרת את כל השושלות של תאי הדם לאורך החיים, נשמרת על ידי אוכלוסייה קטנה הנקראת תאי גזע המטופויאטיים (HSCs). HSCs שומרים על עצמם על ידי חידוש עצמי ומייצרים אבות מחויבים שונים המולידים תאי דם פונקציונליים מובחנים לחלוטין 1,2,3. תהליך זה מוסדר בקפדנות. עם זאת, הצטברות של מוטציות סרטניות בתאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) מעכבת התמיינות נורמלית, מעניקה יכולת שגשוג חריגה, ובסופו של דבר הופכת HSPCs לתאים יוזמי לוקמיה (LICs)4,5,6,7. זיהוי ואישור מוטציות לוקמוגניות עדיין נותר אתגר גדול לחקר הסרטן.

לאחרונה פותחה מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות (CRISPR)/CRISPR הקשורה לחלבון 9 (Cas9) והפכה לשיטת עריכת גנים יעילה ומדויקת, המורכבת מנוקלאז Cas9 ו-RNA חד-מנחה (sgRNA)8. ה-sgRNA מנחה את קומפלקס Cas9-sgRNA למיקום גנומי ספציפי באמצעות השלמת RNA-DNA, כאשר נוקלאז Cas9 גורם לשבירות דו-גדיליות. ה-DNA השבור נתון למנגנוני עריכת גנים אנדוגניים באמצעות תיקון מדויק מכוון הומולוגיה בנוכחות תבניות הומולוגיה או חיבור קצה לא הומולוגי הנוטה לאי-התאמה, מה שמוביל להוספות או מחיקות קטנות9. נכון לעכשיו, מערכת CRISPR/Cas9 הפכה לכלי רב עוצמה לעריכת גנים ממוקדת ולוויסות שעתוק10.

כאן, השתמשנו בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להכניס שינויים גנטיים ב-HSPCs ולאחר מכן ביצענו את בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8) כדי לחקור אם המוטציות שהוכנסו היו קריטיות לשגשוג חריג של HSPCs. באופן ספציפי, תאי מח עצם מועשרים ל-HSPCs נאספו מעכברי Cas9 ואחריהם טרנספקציה ויראלית עם sgRNAs המכוונים לגנים מועמדים. לאחר מכן, בוצעה בדיקת CCK-8 כדי לקבוע אם המוטציות העניקו יכולת שגשוג מוגברת ל-HSPCs שעברו טרנספטציה. לבסוף, המוטציות שהוצגו על ידי CRISPR/Cas9 אושרו על ידי מעקב אחר Indels על ידי פירוק (TIDE)11 או רצף עמוק ממוקד12. פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה להערכת מוטציות סרטניות ומטרות טיפוליות פוטנציאליות ללוקמיה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שנערכו תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ורווחה בבעלי חיים של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.

1. בניית פלסמידים sgRNA המכוונים לגנים מועמדים (4 - 5 ימים)

  1. תכנן את ה-sgRNA הממוקד באמצעות כלי עיצוב sgRNA מקוונים. הזן את רצף ה-DNA הגנומי של היעד לכלי עיצוב sgRNA מקוון (למשל, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). בחר את מטרות ה-sgRNA המתאימות וסדר את האוליגונוקלאוטידים הדרושים.
  2. הכן את תוספות ה-sgRNA oligo. השעו מחדש את הגדילים העליונים והתחתונים של האוליגו המעוצבים עבור כל sgRNA (שלב 1.1) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. הכן תערובות לפי טבלה 1 כדי לזרחן ולחשל את אוליגוס ה-sgRNA. השתמש בפרמטרים הבאים של רכיבה תרמית: 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; רמפה עד 25 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס מינימום-1.
  3. הוסף 1 מיקרוליטר של האוליגו הזרחני והחישול ל-199 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר ddH2O כדי להשיג יחס דילול של 1:200.
  4. ליניאריזציה של הפלסמיד הווקטורי.
    1. באמצעות וקטור עמוד השדרה המוזכר (ראה טבלת החומרים), עכל את הפלסמיד הווקטורי באמצעות אנזים ההגבלה Esp3I (BsmBI). הגדר את התגובות לפי טבלה 1 ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    2. הוסף 0.5 מיקרוליטר של פוספטאז אלקליין שרימפס (rSAP) לאותו צינור ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפחית את ההסתברות לצימוד אוטומטי של הפלסמיד הליניארי.
    3. בדוק אם יש ליניאריזציה מוצלחת. טען את הפלסמידים הליניאריים והפלסמידים הלא חתוכים לאלקטרופורזה על ג'ל אגרוז של 0.8-1% (w/v).
    4. טהר את הפלסמיד הליניארי עם ערכת טיהור PCR, הוצא פנימה 20 מיקרוליטר של ddH2O, וכמת את ריכוז ה-DNA.
  5. שיבוט האוליגוס sgRNA לתוך הפלסמיד הווקטורי על ידי הגדרת תגובות הקשירה עבור כל sgRNA לפי טבלה 1. דגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  6. לטרנספורמציה, הוסף 10 מיקרוליטר של המוצר משלב 1.5 ל-50 מיקרוליטר של תאי Stbl3 מוכשרים כקרח, דגר את התערובת על קרח למשך 30 דקות, הלם אותה בחום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ולאחר מכן החזר אותה מיד לקרח למשך 2 דקות. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום LB נטול אנטיביוטיקה לאותו צינור, נער ב-220 סל"ד למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צלח אותו על צלחת LB המכילה 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דוגרים את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  7. למחרת, בדוק את הצלחות לצמיחת המושבה. מכל צלחת, בחר 6-8 מושבות ובדוק אם יש החדרה נכונה של sgRNA באמצעות PCR מושבה. בחר מושבות חיוביות וחסן מושבות בודדות ל-5 מ"ל של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין באמצעות קצה פיפטה סטרילי. דגרו ונערו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  8. בודד את ה-DNA של הפלסמיד מתרביות באמצעות ערכת טיהור DNA מיני פלסמיד. רצף ממקדם U6 כדי לוודא שרצף ההנחיה של 20-nt מוכנס כהלכה.

2. אריזות לנטי-ויראליות (2-3 ימים)

  1. תרבית תאי HEK 293T במדיום DMEM בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% (v/v) תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  2. העבירו את HEK293T התאים על ידי שאיבת המדיום הישן מצלחת הפטרי ושטפו את הכלי בעדינות פי 2 עם 3 מ"ל PBS. מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לכלי בגודל 10 ס"מ ודוגרים אותו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה. הוסף 3 מ"ל של מדיום DMEM חם לתבשיל כדי לנטרל את הטריפסין, אסוף את התאים לצינור של 15 מ"ל וסובב בחום של 800 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-5 מ"ל של מדיום, וצלחו את התאים לכלים חדשים לפי הצורך.
    הערה: השתמש בתאי HEK 293T עם פחות מ-10 מעברים לייצור וירוס לנטי.
  3. שש עשרה עד 24 שעות לפני הטרנספקציה, זרעו את HEK293T התאים לצלחות של 10 ס"מ בצפיפות של 2-4 × 106 תאים למנה. ודא שה-DMEM המשמש נטול אנטיביוטיקה.
  4. ודא שהתאים מתכנסים 70-80% ביום הטרנספקציה. הפוך 10-15 מיקרוגרם פלסמיד לכל צלחת של 10 ס"מ ושמור על היחס המולרי של פלסמיד ל-PEI 1:3. מכינים מערבבים 1 ומערבבים 2 להעברה לפי טבלה 2.
  5. הניחו לתערובת 2 לעמוד למשך 5 דקות. הוסיפו את תערובת 2 לערבוב 1 (היזהרו לא להפוך את סדר ההוספה), ערבבו היטב ולאחר מכן הניחו לו לעמוד למשך 15-20 דקות.
  6. מוסיפים את הקומפלקס (שלב 2.5) לתאים, מנערים את המנה בעדינות לערבוב, ודוגרים בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 . שש עד 8 שעות לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום DMEM (המכיל 10% FBS).
  7. יומיים לאחר תחילת הטרנספקציה הלנטי-ויראלית, אספו את הסופרנטנטים של ה-lentivirus מהכלים. צנטריפוגה ב-4,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ומסנן דרך קרום מיקרו-סינון של 0.45 מיקרומטר. יש להוציא את ה-lentivirus ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לרכז את נגיף הלנטי שנאסף לפי הצורך. הימנע מהפחתת טיטרים נגיפיים עקב הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.

3. מיצוי ותרבית תאי מח עצם (12 - 13 ימים)

הערה: כל קווי העכבר נשמרו ברקע גנטי טהור של C57BL/6. עכברי LSL-Cas9 (T002249) הוכלאו עם עכברי Mx1-Cre13 כדי ליצור LSL-Cas9/+; Mx1-Cre/+ עכברים. כאן, אספנו תאי מח עצם מ-Mx1-Cre/+; עכברי LSL-Cas9/+ וחבריהם לשגר.

  1. כדי לגרום לביטוי של Cre recombinase, יש להזריק לעכברים (בני 8-12 שבועות) תוך צפקית 150 מיקרוליטר של פוליאינוזינית-פוליציטידילית (1.5 מ"ג/מ"ל) ביום 1 וביום 3. ביום השישי יש להזריק לעכברים 5-פלואורואורציל (5-FU, 150 מ"ג/ק"ג).
    הערה: עכברים טרנסגניים Mx1-Cre מתוכננים לבטא Cre recombinase בשליטת מקדם Mx113 הניתן להשראה. הזרקה תוך-צפקית של פולינוזינית-פוליציטידילית יכולה להפעיל ביעילות את מקדם Mx1 ולגרום לביטוי Cre recombinase14. הזרקת 5-FU משמשת לדלדול תאים מתרבים במח העצם, ובכך לגרום ל-HSCs להיכנס למחזור התא וכתוצאה מכך שפע יחסי של HSPCs15. ניתן לקצור כ-2-4 ×-10-6 תאי מח עצם לכל עכבר לאחר טיפול ב-5-FU.
  2. ביום ה-11, הקריבו את העכברים על ידי חנקCO2 . קח את עצם הירך והשוק של העכברים, שטוף את חלל מח העצם עם PBS המכיל 2% FBS באמצעות מזרק סטרילי של 1 מ"ל, ואסוף תאי מח עצם כפי שתואר על ידי Gavrilescu et al.16.
    הערה: העבירו את העצמות למכסה זרימה למינרי ברגע שמסירים את השוקה והפיבולה מהעכברים כדי לשמור על סטריליות במהלך איסוף תאי מח העצם.
  3. חלקו את תאי מח העצם למעלה ולמטה (פי 30-50) כדי לפזר אותם לתאים בודדים, ואז העבירו את תערובת התאים לצינור של 50 מ"ל, ומערבולת כדי להתערבב היטב.
  4. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התא ל-40 מיקרוליטר של מאגר ליזה אריתרוציטים והנח אותו על קרח למשך 5 דקות כדי לאפשר לאריתרוציטים ליז. מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסה כחולה טריפאן, מערבבים היטב וסופרים תאים ברי קיימא.
  5. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  6. השעו מחדש את התאים ב-1-2 ×-106 תאים/מ"ל במדיום קדם-גירוי של מח העצם כמתואר בטבלה 3. זרעו את התאים בכלים של 10 ס"מ, 10 מ"ל לצלחת ודגרו למשך 24 שעות.

4. טרנספקציה לנטיוויראלית של תאי מח עצם (2-3 ימים)

  1. למחרת, אספו תאים מהצלחות המגורות מראש. שוטפים את הצלחת במרץ עם 5 --10 מ"ל PBS המכיל 2% FBS. ספור את התאים הקיימים על ידי הוספת טריפן כחול כמתואר בשלב 3.4.
  2. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכן את תמיסת זיהום הנגיף כמתואר בטבלה 4.
  3. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בתמיסת זיהום טרייה שהוכנה (∼106 תאים/מ"ל). זרעו את התאים התלויים לצלחת של 6 בארות, 4 מ"ל לבאר. אוטמים את צלחת 6 הבארות עם פרפילם וצנטריפוגה את הצלחת ב-1,500 × גרם למשך 90 דקות ב-32 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר הצנטריפוגה, השעו את התאים בעדינות בעזרת פיפטה (אך אל תשנו את המדיום), ואז דגרו את הצלחת למשך 4-6 שעות בחממה.
  5. עבור הטרנספקציה הראשונה, שאפו כמה שיותר מדיום סופרנטנט מכל באר (~3 מ"ל) בזהירות והוסיפו נפח שווה של מדיום קדם גירוי מח עצם. אם תאים מסוימים נשאבים בטעות במהלך ההליך, צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים עם כמות קטנה של מדיום קדם-גירוי, ואז הוסיפו אותם בחזרה לבאר.
  6. עבור הטרנספקציה המשנית, למחרת, הסר 2-3 מ"ל של מדיום מכל באר והוסף נפח שווה של תמיסת מלאי רטרו-ויראלית שהופשרה לאחרונה יחד עם כמויות מתאימות של HEPES ופוליברן כמתואר בטבלה 4. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 1,500 × גרם למשך 90 דקות, 37 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר הצנטריפוגה, השעו בעדינות את התאים והמשיכו לדגור את הצלחת בחממה למשך 4-6 שעות.
  8. החלף את המדיום כמו בשלב 4.5. דגירה למשך 24 שעות.

5. בצע בדיקת CCK-8 במבחנה (3 - 4 ימים)

  1. שוטפים במרץ את הבארות כדי לאסוף תאי מח עצם. שוטפים את הצלחת עם PBS המכיל 2% FBS כדי להשיג את המספר המרבי של תאים. סנן את התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר וספור את התאים הקיימים עם טריפאן כחול כמתואר בשלב 3.4.
  2. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. השעו מחדש את התאים עם DMEM המכיל 10% FBS ו-mIL-3, mIL-6 (10 ננוגרם/מ"ל), mSCF (100 ננוגרם/מ"ל) ל-1 ×-105 תאים/מ"ל. קח ~0.5-1 × 106 תאים וצנטריפוגה בחום של 800 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את כדור התא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למיצוי DNA גנומי.
  4. הוסף את התאים לצלחות של 96 בארות בצפיפות של 1 × 104 תאים לבאר. הכינו שש בארות שכפול לכל קבוצה. הוסף 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי למעגל בארות סביב הבארות בהן נזרעים התאים. דגירה למשך 0, 24, 48 ו-72 שעות.
  5. שאפו בזהירות את המדיום מצלחת 96 הבארות בנקודת הזמן המתאימה. הוסף 110 מיקרוליטר של מדיום המכיל 1/10 נפח של CCK-8 לבארות. הגדר קבוצה ריקה (בינונית ו-CCK-8 בלבד, ללא תאים). דגירה בחממה למשך שעה.
  6. קרא את ערך הספיגה של 450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה.
  7. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לנתח את נתוני הניסוי, ולבטא את נתוני הניסוי כממוצע ± סטיית תקן (ממוצע ± SD). נתח את ההבדלים בין שתי הקבוצות באמצעות מבחן t של מדגמים בלתי תלויים, כאשר P < 0.05 מצביע על הבדל מובהק סטטיסטית.

6. אימות עריכת גנים (5 - 7 ימים)

  1. חלץ את ה-DNA הגנומי (שלב 5.3) באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי בהתאם להמלצות היצרן.
  2. תכנן פריימרים המגדילים את אזור ה-200 עד 500 bp המרוכז סביב אתר החיתוך sgRNA (טבלה 5).
  3. לריצוף סנגר, הכינו את התערובת כמו בטבלה 6 ל-PCR. הגבירו את שברי גן המטרה באמצעות תרמוסייקלר באופן הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 40 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 9 שניות), 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס ∞.
    הערה: ניתן לאמת עריכת גנים גם באמצעות ריצוף מהדור הבא (NGS), ויש לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ל-NGS.
  4. נתח את תוצאות ריצוף Sanger באתר TIDE (http://tide.nki.nl). חשב את יעילות העריכה של sgRNA על ידי הזנת רצף sgRNA ותוצאות הריצוף מקבוצות ניסוי ובקרה לכלי מקוון זה.
    הערה: נתח את תוצאות ה-NGS באמצעות CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17. הזן קריאות קצה זוגי (שני קבצים) או קריאות קצה יחיד (קובץ יחיד) בפורמט fastq או fastq.gz מניסוי ריצוף עמוק, יחד עם רצף התייחסות ורצף sgRNA. התוכנה תעריך ותכמת את המוטגנזה הממוקדת.

תוצאות

השפעת נוקאאוט Trp53 על יכולת ההתפשטות של HSPCs של עכברים
כאן, השתמשנו בנוקאאוט Trp53 כדוגמה כדי להדגים את הפרוטוקול הזה. כדי לחקור את ההשפעה של נוקאאוט Trp53 על יכולת ההתפשטות של HSPCs בעכברים, השתמשנו בטרנספקציה לנטי-ויראלית כדי להכניס

Discussion

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי בשל אופייה הידידותי למשתמש ויעילותה הגבוהה, מה שמקל על יישום כגון בדיקת תפקודי גנים18, מודלים של מחלות19, אימונותרפיה20 ותיוג והדמיה של תאים חיים21. מחקרים אחרונים ערכו ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לאוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית על השימוש בשירותים המשותפים שלה להשלמת מחקר זה. העבודה הזו נתמכה על ידי קרן המדענים הצעירים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 31701280 ל-J. Zhang).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm microfiltration membraneSartoriu16533K-1
1.5 mL EP tubeLABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm dishCorning430167
15 mL TubeLABLEADLXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)Accurate BiologyAG11010For colony PCR
50 mL TubeLABLEADLXG5000
5-FluorouracilSigmaF6627-1
6-well plateCorning3516
70 µm cell sieveFalcon®352350
96-well platesCorning3599
ACK Lysis BufferLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpicillinSolarbioA8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCRThermofisher
Cell Counting Kit-8BimakeB34304
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5810R
CO2 IncubatorThermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5ZYMOD4014
Dneasy Blood & Tissure KitQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Fetal Bovine SerumExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC;Virginia,USA
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963backbone vector
LSL-Cas9 miceModel Animal
Research Center of
NANJING UNIVERSITY 		T002249
microplate absorbance spectrophotometerBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xSolarbioP1400
pMD2.G plasmidAddgene12259
polybreneBeyotimeC0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium saltSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen28104
RecombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RecombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Regular agaroseBIOWESTBY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro SpectrophotometerMOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cellsBioMedBC108-01 
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201L
T4-LigaseTakara2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid KitTIANGENDP105-03
Trypan Blue solutionLABLEADC0040-100ml
Trypsin-EDTAGibco25200072
TryptoneOXOIDLP0042
WEHI-CMNanjing Fuksai Biotechnology CBP50079
YEAST EXTRACTOXOIDLP0021

References

  1. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  4. Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml. Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).
  5. Chopra, M., Bohlander, S. K. The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).
  6. Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all. Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).
  7. González-García, S., et al. IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763-763 (2003).
  10. Wang, S. -. W., et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 21 (1), (2022).
  11. Zhao, C., et al. HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control. Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).
  12. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  13. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  14. Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell. 62 (1), 51-61 (1990).
  15. Randall, T. D., Weissman, I. L. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).
  16. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).
  17. Pinello, L., et al. Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso. Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).
  18. Cai, P., et al. A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis. Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).
  19. Ng, S. R., et al. CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).
  20. Crowther, M. D., et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1. Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).
  21. Ma, H., et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).
  22. Szlachta, K., et al. CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response. Nat Commun. 9 (1), 4275 (2018).
  23. Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions. Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).
  24. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).
  25. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE219CRISPR Cas9CCK 8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved