Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che integra la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per identificare i geni candidati che sono cruciali per l'anomala capacità proliferativa delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche possiedono la capacità di auto-rinnovamento a lungo termine e il potenziale di differenziarsi in vari tipi di cellule del sangue mature. Tuttavia, l'accumulo di mutazioni cancerose nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) può bloccare la normale differenziazione, indurre una proliferazione aberrante e, infine, portare alla leucemogenesi. Per identificare e/o valutare le mutazioni cancerose, abbiamo integrato la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per studiare un gene modello Trp53, che è essenziale per l'anomala capacità proliferativa delle HSPC. In particolare, le cellule del midollo osseo arricchite per le HSPC da topi Cas9 sono state raccolte e quindi sottoposte a trasfezione virale con RNA a guida singola (sgRNA) che hanno come bersaglio uno o più geni candidati per introdurre alterazioni genetiche nelle HSPC. Quindi, è stato eseguito un test CCK-8 per studiare la capacità proliferativa delle HSPC trasfettate. L'efficienza del targeting dell'sgRNA è stata confermata da un saggio di tracciamento degli Indels mediante decomposizione. Questi geni identificati possono svolgere un ruolo cruciale nella leucemogenesi e potrebbero fungere da potenziali bersagli terapeutici.

Introduzione

L'emopoiesi, che produce tutti i lignaggi di cellule del sangue per tutta la vita, è mantenuta da una piccola popolazione chiamata cellule staminali ematopoietiche (HSC). Le HSC si mantengono auto-rinnovandosi e producono vari progenitori impegnati che danno origine a cellule del sangue funzionali completamente differenziate ^1,2,3. Questo processo è strettamente regolamentato. Tuttavia, l'accumulo di mutazioni cancerose nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) impedisce la normale differenziazione, conferisce una capacità proliferativa anormale e, infine, trasforma le HSPC in cellule che iniziano la leucemia (LIC)4,5,6,7. L'identificazione e la conferma delle mutazioni leucemogeniche rimane ancora una grande sfida per la ricerca sul cancro.

Recentemente, il sistema CRISPR/proteina 9 associata a CRISPR (CRISPR) è stato sviluppato ed è diventato un metodo di editing genetico efficiente e preciso, costituito dalla nucleasi Cas9 e dall'RNA a guida singola (sgRNA)⁸. L'sgRNA guida il complesso Cas9-sgRNA verso una specifica posizione genomica attraverso la complementarità RNA-DNA, dove la nucleasi Cas9 induce rotture a doppio filamento. Il DNA rotto è sottoposto a meccanismi di editing genico endogeno attraverso una precisa riparazione diretta dall'omologia in presenza di modelli di omologia o un'unione terminale non omologa soggetta a disallineamento, che porta a piccole inserzioni o delezioni⁹. Attualmente, il sistema CRISPR/Cas9 è diventato un potente strumento per l'editing genico mirato e la regolazione trascrizionale¹⁰.

Qui, abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 per introdurre alterazioni genetiche nelle HSPC e poi abbiamo eseguito il test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per indagare se le mutazioni introdotte fossero fondamentali per la proliferazione anomala delle HSPC. In particolare, le cellule del midollo osseo arricchite per le HSPC sono state raccolte da topi Cas9 seguite da trasfezione virale con sgRNA mirati a geni candidati. Quindi, è stato eseguito il test CCK-8 per determinare se le mutazioni conferivano una maggiore capacità proliferativa alle HSPC trasfettate. Infine, le mutazioni introdotte da CRISPR/Cas9 sono state confermate dal Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹¹ o dalla sequenza profonda mirata¹². Questo protocollo fornisce un potente strumento per valutare le mutazioni cancerose e i potenziali bersagli terapeutici per la leucemia.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali condotti nell'ambito di questo protocollo sono stati approvati dal Comitato per la cura e il benessere degli animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino.

1. Costruzione di plasmidi sgRNA mirati a geni candidati (4 - 5 giorni)

1. Progetta l'sgRNA di targeting utilizzando strumenti di progettazione di sgRNA online. Inserire la sequenza di DNA genomico target in uno strumento di progettazione di sgRNA online (ad esempio, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Selezionare i bersagli sgRNA appropriati e ordinare gli oligonucleotidi necessari.
2. Preparare gli inserti oligo sgRNA. Risospendere i filamenti superiore e inferiore degli oligo progettati per ciascun sgRNA (fase 1.1) fino a una concentrazione finale di 100 μM. Preparare le miscele secondo la tabella 1 per fosforilare e ricuocere gli oligo di sgRNA. Utilizzare i seguenti parametri di termociclo: 37 °C per 30 min; 95 °C per 5 min; scendere a 25 °C a 5 °C min⁻¹.
3. Aggiungere 1 μL di oligo fosforilato e ricotto a 199 μL di ddH₂O a temperatura ambiente per ottenere un rapporto diluito di 1:200.
4. Linearizzare il plasmide vettoriale.
   1. Utilizzando il vettore backbone di riferimento (vedere la Tabella dei materiali), digerire il plasmide vettore utilizzando l'enzima di restrizione Esp3I (BsmBI). Impostare le reazioni secondo la tabella 1 e incubare a 55 °C per 1 ora.
   2. Aggiungere 0,5 μl di fosfatasi alcalina di gamberetti (rSAP) alla stessa provetta e incubare a 37 °C per 30 minuti per ridurre la probabilità di autoconiugazione del plasmide lineare.
   3. Verificare la corretta linearizzazione. Caricare i plasmidi linearizzati e i plasmidi non tagliati per l'elettroforesi su un gel di agarosio allo 0,8-1% (p/v).
   4. Purificare il plasmide linearizzato con un kit di purificazione PCR, eluire in 20 μL di ddH₂O e quantificare la concentrazione di DNA.
5. Clonare gli oligo di sgRNA nel plasmide vettore impostando le reazioni di ligazione per ciascun sgRNA secondo la Tabella 1. Incubare a 16 °C per 4 ore.
6. Per la trasformazione, aggiungere 10 μL di prodotto dalla fase 1,5 in 50 μL di cellule Stbl3 competenti ghiacciate, incubare la miscela su ghiaccio per 30 minuti, sottoporla a shock termico a 42 °C per 90 s, quindi rimetterla prontamente in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 200 μL di terreno LB privo di antibiotici nella stessa provetta, agitare a 220 giri/min per 30 minuti a 37 °C, quindi impiattarlo su una piastra LB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
7. Il giorno successivo, esamina le piastre per la crescita delle colonie. Da ogni piastra, selezionare 6-8 colonie e verificare il corretto inserimento dell'sgRNA utilizzando la PCR delle colonie. Selezionare le colonie positive e inoculare le singole colonie in 5 mL di terreno LB contenente 100 μg/mL di ampicillina utilizzando un puntale per pipetta sterile. Incubare e agitare la coltura a 37 °C per una notte.
8. Isolare il DNA plasmidico dalle colture utilizzando un mini kit di purificazione del DNA plasmidico. Sequenza dal promotore U6 per assicurarsi che la sequenza di guida a 20 nt sia inserita correttamente.

2. Confezionamento lentivirale (2 - 3 giorni)

1. Coltura di cellule HEK 293T in terreno DMEM integrate con siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e soluzione di penicillina-streptomicina all'1% (v/v) a 37 °C e CO₂ al 5%.
2. Far passare le cellule HEK293T aspirando il vecchio terreno dalla piastra di Petri e lavare delicatamente la piastra 2 volte con 3 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina in una piastra di 10 cm e incubare a 37 °C per 1 min. Aggiungere 3 ml di terreno DMEM caldo al piatto per inattivare la tripsina, raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 800 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 5 mL di terreno e placcare le cellule in nuovi piatti, se necessario.
   NOTA: Utilizzare cellule HEK 293T con meno di 10 passaggi per la produzione di lentivirus.
3. Da sedici a 24 ore prima della trasfezione, seminare le cellule HEK293T in piastre da 10 cm a una densità di 2-4 × 10⁶ celle per piastra. Assicurarsi che il DMEM utilizzato sia privo di antibiotici.
4. Assicurarsi che le cellule siano confluenti al 70-80% il giorno della trasfezione. Trasformare 10-15 μg di plasmide per piatto da 10 cm e mantenere il rapporto molare tra plasmide e PEI 1:3. Preparare la Miscela 1 e la Miscela 2 per la trasfezione secondo la Tabella 2.
5. Lasciare riposare il Mix 2 per 5 minuti. Aggiungere il Mix 2 al Mix 1 (fare attenzione a non invertire l'ordine di aggiunta), mescolare accuratamente e poi lasciare riposare per 15-20 minuti.
6. Aggiungere il complesso (passaggio 2.5) alle cellule, agitare delicatamente la capsula per mescolare e incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ . Da sei a 8 ore dopo, sostituire il terreno con un terreno DMEM (contenente il 10% di FBS).
7. Due giorni dopo l'inizio della trasfezione lentivirale, raccogliere i surnatanti del lentivirus dai piatti. Centrifugare a 4.000 × g per 10 min a 4 °C e filtrare attraverso una membrana di microfiltrazione da 0,45 μm. Erogare il lentivirus e conservare a -80 °C.
   NOTA: Il lentivirus raccolto può essere concentrato secondo necessità. Evitare di ridurre i titoli virali a causa del congelamento e dello scongelamento ripetuti.

3. Estrazione e coltura di cellule del midollo osseo (12 - 13 giorni)

NOTA: Tutte le linee di topi sono state mantenute in un background genetico C57BL/6 puro. I topi LSL-Cas9 (T002249) sono stati incrociati con i topi Mx1-Cre¹³ per generare LSL-Cas9/+; Mx1-Cre/+ topi. Qui, abbiamo raccolto cellule del midollo osseo da Mx1-Cre/+; Topi LSL-Cas9/+ e i loro compagni di cucciolata.

1. Per indurre l'espressione di Cre ricombinasi, iniettare nei topi (8-12 settimane) per via intraperitoneale 150 μL di poliinosinico-policitidilico (1,5 mg/mL) il giorno 1 e il giorno 3. Il giorno 6, iniettare i topi per via intraperitoneale con 5-fluorouracile (5-FU, 150 mg/kg).
   NOTA: I topi transgenici Mx1-Cre sono ingegnerizzati per esprimere la ricombinasi Cre sotto il controllo del promotore inducibile Mx1¹³. L'iniezione intraperitoneale di poliinosinico-policitidilico può attivare efficacemente il promotore Mx1 e indurre l'espressione della ricombinasi Cre¹⁴. L'iniezione di 5-FU viene utilizzata per esaurire le cellule proliferanti nel midollo osseo, inducendo così le HSC ad entrare nel ciclo cellulare e determinando una relativa abbondanza di HSPC¹⁵. Dopo il trattamento con 5-FU, è possibile raccogliere circa 2-4 × 10⁶ cellule di midollo osseo per topo.
2. L'11° giorno, sacrificare i topi per asfissia da CO₂ . Prendi il femore e la tibia dei topi, lava la cavità del midollo osseo con PBS contenente il 2% di FBS utilizzando una siringa sterile da 1 ml e raccogli le cellule del midollo osseo come descritto da Gavrilescu et ^al.16.
   NOTA: Trasferire le ossa in una cappa a flusso laminare non appena la tibia e il perone vengono rimossi dai topi per mantenere la sterilità durante la raccolta delle cellule del midollo osseo.
3. Pipetettare le cellule del midollo osseo su e giù (30-50x) per disperderle in singole cellule, quindi trasferire la miscela di cellule in una provetta da 50 ml e agitare per mescolare bene.
4. Aggiungere 10 μl di sospensione cellulare a 40 μl di tampone di lisi eritrocitaria e metterlo su ghiaccio per 5 minuti per consentire agli eritrociti di lisi. Aggiungere 50 μl di soluzione di blu di tripano, mescolare bene e contare le cellule vitali.
5. Centrifugare le celle a 800 × g per 15 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante.
6. Risospendere le cellule a 1-2 × 10⁶ cellule/mL nel terreno di prestimolazione del midollo osseo come descritto nella Tabella 3. Seminare le cellule in piastre da 10 cm, 10 ml/piastra e incubare per 24 ore.

4. Trasfezione lentivirale di cellule del midollo osseo (2 - 3 giorni)

1. Il giorno successivo, raccogliere le cellule dalle piastre prestimolate. Sciacquare energicamente la piastra con 5--10 ml di PBS contenente il 2% di FBS. Contare le celle vitali aggiungendo il blu di tripano come descritto nel passaggio 3.4.
2. Centrifugare le celle a 800 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di infezione virale come descritto nella Tabella 4.
3. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in una soluzione di infezione appena preparata (∼10⁶ cellule/mL). Seminare le cellule sospese in una piastra a 6 pozzetti, 4 mL per pozzetto. Sigillare la piastra a 6 pozzetti con parafilm e centrifugare la piastra a 1.500 × g per 90 minuti a 32 °C.
4. Dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente le cellule con una pipetta (ma non cambiare il terreno), quindi incubare la piastra per 4-6 ore in un'incubatrice.
5. Per la prima trasfezione, aspirare con attenzione la maggior quantità possibile di terreno surnatante da ciascun pozzetto (~3 mL) e aggiungere un volume uguale di terreno di prestimolazione del midollo osseo. Se alcune cellule vengono accidentalmente aspirate durante la procedura, centrifugare a 800 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante, risospendere le cellule con una piccola quantità di terreno di prestimolazione e poi aggiungerle nuovamente al pozzetto.
6. Per la trasfezione secondaria, il giorno successivo, rimuovere 2-3 mL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere un volume uguale di soluzione madre retrovirale appena scongelata insieme a quantità appropriate di HEPES e polibrene come descritto nella Tabella 4. Centrifugare la piastra a 1.500 × g per 90 min, 37 °C.
7. Dopo la centrifugazione, risospendere delicatamente le cellule e continuare a incubare la piastra nell'incubatore per 4-6 ore.
8. Sostituire il fluido come al punto 4.5. Incubare per 24 ore.

5. Eseguire il test CCK-8 in vitro (3 - 4 giorni)

1. Sciacquare energicamente i pozzetti per raccogliere le cellule del midollo osseo. Lavare la piastra con PBS contenente il 2% di FBS per ottenere il numero massimo di celle. Filtrare le cellule attraverso un setaccio da 70 μm e contare le cellule vitali con il blu di tripano come descritto al punto 3.4.
2. Centrifugare le celle a 800 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Risospendere le cellule con DMEM contenente il 10% di FBS e mIL-3, mIL-6 (10 ng/mL), mSCF (100 ng/mL) a 1 × 10⁵ cellule/mL. Prelevare ~0,5-1 × 10⁶ celle e centrifugare a 800 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e conservare il pellet cellulare a -80 °C per l'estrazione del DNA genomico.
4. Aggiungere le celle in piastre a 96 pozzetti alla densità di 1 × 10⁴ celle per pozzetto. Crea sei pozzetti di replica per ogni gruppo. Aggiungere 100 μl di PBS sterile in un cerchio di pozzetti attorno ai pozzetti in cui vengono seminate le cellule. Incubare per 0, 24, 48 e 72 ore.
5. Aspirare con cautela il fluido dalla piastra a 96 pozzetti al momento corrispondente. Aggiungere 110 μl di terreno contenente 1/10 di volume di CCK-8 ai pozzetti. Imposta un gruppo vuoto (solo medium e CCK-8, nessuna cella). Incubare nell'incubatore per 1 ora.
6. Leggere il valore di assorbanza di 450 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
7. Utilizzare software statistici per analizzare i dati sperimentali ed esprimere i dati sperimentali come media ± deviazione standard (media ± SD). Analizza le differenze tra i due gruppi utilizzando il t-test a campioni indipendenti, con P < 0,05 che indica una differenza statisticamente significativa.

6. Verifica dell'editing genetico (5 - 7 giorni)

1. Estrarre il DNA genomico (passaggio 5.3) utilizzando un kit di purificazione del DNA genomico secondo le raccomandazioni del produttore.
2. Progettare primer che amplificano la regione da 200 a 500 bp centrata attorno al sito di taglio dell'sgRNA (Tabella 5).
3. Per il sequenziamento Sanger, preparare la miscela come nella Tabella 6 per la PCR. Amplificare i frammenti genici bersaglio utilizzando un termociclatore come segue: 95 °C per 5 minuti, 40 cicli (95 °C per 30 s, 58 °C per 30 s, 72 °C per 9 s), 72 °C per 10 min, 4 °C ∞.
   NOTA: L'editing genetico può essere verificato anche utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e il prodotto PCR deve essere purificato utilizzando un kit di purificazione per NGS.
4. Analizza i risultati del sequenziamento Sanger sul sito web TIDE (http://tide.nki.nl). Calcola l'efficienza di editing dell'sgRNA inserendo la sequenza di sgRNA e i risultati del sequenziamento sia dai gruppi sperimentali che da quelli di controllo in questo strumento online.
   NOTA: Analizzare i risultati NGS utilizzando CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. Letture accoppiate di input (due file) o letture single-end (file singolo) in formato fastq o fastq.gz da un esperimento di sequenziamento profondo, insieme a una sequenza di riferimento e una sequenza di sgRNA. Il software valuterà e quantificherà la mutagenesi mirata.

Risultati

Effetto del knockout di Trp53 sulla capacità proliferativa delle HSPC di topo
Qui, abbiamo usato il knockout Trp53 come esempio per dimostrare questo protocollo. Per studiare l'effetto del knockout di Trp53 sulla capacità proliferativa delle HSPC di topo, abbiamo impiegato la trasfezione lentivirale per introdurre l'sgRNA Trp53 nelle cellule del midollo osseo che esprimono Cas9 arricchite per le ...

Discussione

La tecnologia CRISPR/Cas9 è stata ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica grazie alla sua natura intuitiva e all'elevata efficienza, facilitando applicazioni come lo screening della funzione genica¹⁸, la modellazione della malattia¹⁹, l'immunoterapia²⁰ e l'etichettatura e l'imaging di cellule vive²¹. Studi recenti hanno condotto uno screening CRISPR su larga scala per identificare nuovi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm microfiltration membrane	Sartoriu	16533K-1
1.5 mL EP tube	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
10 cm dish	Corning	430167
15 mL Tube	LABLEAD	LXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)	Accurate Biology	AG11010	For colony PCR
50 mL Tube	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracil	Sigma	F6627-1
6-well plate	Corning	3516
70 µm cell sieve	Falcon®	352350
96-well plates	Corning	3599
ACK Lysis Buffer	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicillin	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCR	Thermofisher
Cell Counting Kit-8	Bimake	B34304
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
Esp3I (BsmbI)	NEB	R0580L
Fetal Bovine Serum	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC;Virginia,USA
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	backbone vector
LSL-Cas9 mice	Model Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY	T002249
microplate absorbance spectrophotometer	BIO-RAD	xMark™
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Regular agarose	BIOWEST	BY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spectrophotometer	MOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cells	BioMed	BC108-01
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology	CBP50079
YEAST EXTRACT	OXOID	LP0021