Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que integra a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que são cruciais para a capacidade proliferativa anormal de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras.

Resumo

As células-tronco hematopoiéticas possuem a capacidade de auto-renovação a longo prazo e o potencial de se diferenciar em vários tipos de células sanguíneas maduras. No entanto, o acúmulo de mutações cancerígenas em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) pode bloquear a diferenciação normal, induzir proliferação aberrante e, por fim, levar à leucemogênese. Para identificar e/ou avaliar as mutações cancerígenas, integramos a tecnologia CRISPR/Cas9 com o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para investigar um gene modelo Trp53, que é essencial para a capacidade proliferativa anormal de HSPCs. Especificamente, células da medula óssea enriquecidas para HSPCs de camundongos Cas9 foram colhidas e depois submetidas à transfecção viral com RNAs de guia único (sgRNAs) direcionados a um ou vários genes candidatos para introduzir alterações genéticas em HSPCs. Em seguida, um ensaio CCK-8 foi realizado para investigar a capacidade proliferativa de HSPCs transfectados. A eficiência de direcionamento do sgRNA foi confirmada por um ensaio de rastreamento de Indels por decomposição. Esses genes identificados podem desempenhar papéis cruciais na leucemogênese e podem servir como potenciais alvos terapêuticos.

Introdução

A hematopoiese, que produz todas as linhagens de células sanguíneas ao longo da vida, é mantida por uma pequena população chamada células-tronco hematopoiéticas (HSCs). As HSCs se mantêm por auto-renovação e produzem vários progenitores comprometidos que dão origem a células sanguíneas funcionais totalmente diferenciadas ^1,2,3. Este processo é rigidamente regulamentado. No entanto, o acúmulo de mutações cancerígenas em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) impede a diferenciação normal, confere capacidade proliferativa anormal e, por fim, transforma HSPCs em células iniciadoras de leucemia (LICs)4,5,6,7. Identificar e confirmar mutações leucemogênicas ainda continua sendo um grande desafio para a pesquisa do câncer.

Recentemente, o sistema de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/proteína 9 associada a CRISPR (Cas9) foi desenvolvido e se tornou um método de edição de genes eficiente e preciso, consistindo na nuclease Cas9 e RNA de guia único (sgRNA)⁸. O sgRNA guia o complexo Cas9-sgRNA para um local genômico específico por meio da complementaridade RNA-DNA, onde a nuclease Cas9 induz quebras de fita dupla. O DNA quebrado é submetido a mecanismos endógenos de edição de genes, seja por meio de reparo preciso dirigido por homologia na presença de modelos de homologia ou junção final não homóloga propensa a incompatibilidades, o que leva a pequenas inserções ou deleções⁹. Atualmente, o sistema CRISPR/Cas9 tornou-se uma ferramenta poderosa para edição de genes direcionados e regulação transcricional¹⁰.

Aqui, utilizamos a tecnologia CRISPR / Cas9 para introduzir alterações genéticas em HSPCs e, em seguida, realizamos o ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para investigar se as mutações introduzidas eram críticas para a proliferação anormal de HSPCs. Especificamente, as células da medula óssea enriquecidas para HSPCs foram colhidas de camundongos Cas9 seguidas de transfecção viral com sgRNAs direcionados a genes candidatos. Em seguida, o ensaio CCK-8 foi realizado para determinar se as mutações conferiam uma capacidade proliferativa aumentada aos HSPCs transfectados. Finalmente, as mutações introduzidas por CRISPR/Cas9 foram confirmadas pelo Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹¹ ou sequência profunda^{direcionada12}. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para avaliar mutações cancerígenas e potenciais alvos terapêuticos para leucemia.

Protocolo

Todos os experimentos em animais conduzidos sob este protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Bem-Estar Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.

1. Construção de plasmídeos sgRNA direcionados a genes candidatos (4 - 5 dias)

1. Projete o sgRNA de direcionamento usando ferramentas de design de sgRNA online. Insira a sequência de DNA genômico alvo em uma ferramenta de design de sgRNA online (por exemplo, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Selecione os alvos de sgRNA apropriados e solicite os oligonucleotídeos necessários.
2. Prepare as inserções de oligo sgRNA. Ressuspender as fitas superior e inferior dos oligos projetados para cada sgRNA (etapa 1.1) até uma concentração final de 100 μM. Preparar as misturas de acordo com a Tabela 1 para fosforilar e recozer os oligos de sgRNA. Use os seguintes parâmetros de termociclagem: 37 °C por 30 min; 95 °C por 5 min; rampa para 25 °C a 5 °C min⁻¹.
3. Adicione 1 μL dos oligos fosforilados e recozidos a 199 μL de temperatura ambiente ddH₂O para obter uma proporção diluída de 1:200.
4. Linearize o plasmídeo vetorial.
   1. Usando o vetor de backbone referenciado (consulte a Tabela de Materiais), digerir o plasmídeo vetorial usando a enzima de restrição Esp3I (BsmBI). Estabelecer as reacções de acordo com o quadro 1 e incubar a 55 °C durante 1 h.
   2. Adicione 0,5 μL de fosfatase alcalina de camarão (rSAP) ao mesmo tubo e incube a 37 ° C por 30 min para reduzir a probabilidade de autoconjugação do plasmídeo linear.
   3. Verifique se a linearização foi bem-sucedida. Carregue os plasmídeos linearizados e os plasmídeos não cortados para eletroforese em um gel de agarose a 0,8-1% (p / v).
   4. Purificar o plasmídeo linearizado com um kit de purificação por PCR, eluir em 20 μL de ddH₂O e quantificar a concentração de ADN.
5. Clone os oligos de sgRNA no plasmídeo vetorial configurando as reações de ligação para cada sgRNA de acordo com a Tabela 1. Incubar a 16 °C durante 4 h.
6. Para a transformação, adicione 10 μL do produto da etapa 1.5 em 50 μL de células Stbl3 competentes geladas, incube a mistura no gelo por 30 min, choque térmico a 42 ° C por 90 s e, em seguida, retorne-o imediatamente ao gelo por 2 min. Adicione 200 μL de meio LB livre de antibióticos ao mesmo tubo, agite a 220 rpm por 30 min a 37 ° C e, em seguida, coloque-o em uma placa LB contendo 100 μg / mL de ampicilina. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
7. No dia seguinte, examine as placas quanto ao crescimento da colônia. Em cada placa, selecione 6-8 colônias e verifique a inserção correta de sgRNA usando PCR de colônias. Selecione colônias positivas e inocule colônias individuais em 5 mL de meio LB contendo 100 μg / mL de ampicilina usando uma ponta de pipeta estéril. Incubar e agitar a cultura a 37 °C durante a noite.
8. Isole o DNA do plasmídeo das culturas usando um mini kit de purificação de DNA de plasmídeo. Sequência do promotor U6 para certificar-se de que a sequência guia de 20 nt está inserida corretamente.

2. Embalagem lentiviral (2 - 3 dias)

1. Cultura de células HEK 293T em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina a 1% (v/v) a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Passe as células HEK293T aspirando o meio antigo da placa de Petri e lave a placa suavemente 2x com 3 mL de PBS. Adicione 1 ml de tripsina a uma placa de 10 cm e incube-a a 37 °C durante 1 min. Adicione 3 mL de meio DMEM quente ao prato para inativar a tripsina, colete as células em um tubo de 15 mL e gire a 800 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 5 mL de meio e coloque as células em novos pratos, conforme necessário.
   NOTA: Use células HEK 293T com menos de 10 passagens para a produção de lentivírus.
3. Dezesseis a 24 h antes da transfecção, semeie as células HEK293T em placas de 10 cm a uma densidade de 2-4 × 10⁶ células por prato. Certifique-se de que o DMEM usado esteja livre de antibióticos.
4. Certifique-se de que as células sejam 70-80% confluentes no dia da transfecção. Transformar 10-15 μg de plasmídeo por placa de 10 cm e manter a razão molar do plasmídeo em PEI 1:3. Prepare a Mistura 1 e a Mistura 2 para transfecção de acordo com a Tabela 2.
5. Deixe a Mistura 2 repousar por 5 min. Adicione a Mistura 2 à Mistura 1 (tome cuidado para não inverter a ordem de adição), misture bem e deixe repousar por 15-20 min.
6. Adicione o complexo (etapa 2.5) às células, agite suavemente o prato para misturar e incube em uma incubadora a 37 °C e CO₂ a 5%. Seis a 8 h depois, substitua o meio por meio DMEM (contendo 10% de FBS).
7. Dois dias após o início da transfecção de lentivírus, agrupe os sobrenadantes de lentivírus das placas. Centrifugue a 4.000 × g por 10 min a 4 °C e filtre através de uma membrana de microfiltração de 0,45 μm. Dispensar o lentivírus e conservar a -80 °C.
   NOTA: O lentivírus coletado pode ser concentrado conforme necessário. Evite reduzir os títulos virais devido ao congelamento e descongelamento repetidos.

3. Extração e cultura de células da medula óssea (12 - 13 dias)

NOTA: Todas as linhagens de camundongos foram mantidas em um fundo genético C57BL / 6 puro. Camundongos LSL-Cas9 (T002249) foram cruzados com camundongos Mx1-Cre¹³ para gerar LSL-Cas9/+; Camundongos Mx1-Cre/+. Aqui, coletamos células da medula óssea de Mx1-Cre / +; Camundongos LSL-Cas9 / + e seus irmãos de ninhada.

1. Para induzir a expressão de Cre recombinase, injete nos camundongos (8-12 semanas de idade) por via intraperitoneal 150 μL de poliinosínico-policitidílico (1,5 mg / mL) no dia 1 e no dia 3. No dia 6, injete nos camundongos por via intraperitoneal 5-fluorouracil (5-FU, 150 mg / kg).
   NOTA: Os camundongos transgênicos Mx1-Cre são projetados para expressar Cre recombinase sob o controle do promotor Mx1 induzível¹³. A injeção intraperitoneal de poliinosínico-policitidílico pode efetivamente ativar o promotor Mx1 e induzir a expressão de Cre recombinase¹⁴. A injeção de 5-FU é utilizada para esgotar as células em proliferação na medula óssea, induzindo as HSCs a entrar no ciclo celular e resultando em uma abundância relativa de HSPCs¹⁵. Aproximadamente 2-4 × 10⁶ células da medula óssea podem ser colhidas por camundongo após o tratamento com 5-FU.
2. No dia 11, sacrifique os camundongos por asfixia com CO₂ . Pegue o fêmur e a tíbia dos camundongos, lave a cavidade da medula óssea com PBS contendo 2% de FBS usando uma seringa estéril de 1 mL e colete as células da medula óssea conforme descrito por Gavrilescu et ^al.16.
   NOTA: Transfira os ossos para uma capa de fluxo laminar assim que a tíbia e a fíbula forem removidas dos camundongos para manter a esterilidade durante a coleta de células da medula óssea.
3. Pipet as células da medula óssea para cima e para baixo (30-50x) para dispersá-las em células únicas, depois transfira a mistura de células para um tubo de 50 mL e vórtice para misturar bem.
4. Adicione 10 μL da suspensão celular a 40 μL de tampão de lise eritrocitária e coloque-o no gelo por 5 min para permitir que os eritrócitos se lisem. Adicione 50 μL de solução de azul de tripano, misture bem e conte as células viáveis.
5. Centrifugar as células a 800 × g durante 15 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
6. Ressuspenda as células a 1-2 × 10⁶ células / mL em meio de pré-estimulação da medula óssea, conforme descrito na Tabela 3. Semeie as células em placas de 10 cm, 10 mL / placa e incube por 24 h.

4. Transfecção lentiviral de células da medula óssea (2 - 3 dias)

1. No dia seguinte, colete células das placas pré-estimuladas. Enxágue a placa vigorosamente com 5 --10 mL de PBS contendo 2% de FBS. Conte as células viáveis adicionando azul de tripano, conforme descrito na etapa 3.4.
2. Centrifugue as células a 800 × g por 10 min em temperatura ambiente. Prepare a solução de spinfection viral conforme descrito na Tabela 4.
3. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em solução de infeção recém-preparada (∼10⁶ células/ml). Semeie as células suspensas em uma placa de 6 poços, 4 mL por poço. Sele a placa de 6 poços com parafilme e centrifugue a placa a 1.500 × g por 90 min a 32 °C.
4. Após a centrifugação, ressuspenda as células suavemente com uma pipeta (mas não mude o meio) e, em seguida, incube a placa por 4-6 h em uma incubadora.
5. Para a primeira transfecção, aspire o máximo possível de meio sobrenadante de cada poço (~ 3 mL) cuidadosamente e adicione um volume igual de meio de pré-estimulação da medula óssea. Se algumas células forem acidentalmente aspiradas durante o procedimento, centrifugue a 800 × g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células com uma pequena quantidade de meio de pré-estimulação e adicione-as de volta ao poço.
6. Para a transfecção secundária, no dia seguinte, remova 2-3 mL de meio de cada poço e adicione um volume igual de solução estoque retroviral recém-descongelada junto com quantidades apropriadas de HEPES e polibreno, conforme descrito na Tabela 4. Centrifugar a placa a 1.500 × g durante 90 min, 37 °C.
7. Após a centrifugação, ressuspenda suavemente as células e continue a incubar a placa na incubadora por 4-6 h.
8. Substitua o meio como na etapa 4.5. Incubar por 24 h.

5. Realizar o ensaio CCK-8 in vitro (3 - 4 dias)

1. Enxágue vigorosamente os poços para coletar as células da medula óssea. Lave a placa com PBS contendo 2% de FBS para obter o número máximo de células. Filtrar as células através de um peneiro de 70 μm e contar as células viáveis com azul de tripano, conforme descrito no passo 3.4.
2. Centrifugue as células a 800 × g por 10 min em temperatura ambiente.
3. Ressuspenda as células com DMEM contendo 10% de FBS e mIL-3, mIL-6 (10 ng / mL), mSCF (100 ng / mL) para 1 × 10⁵ células / mL. Pegue ~ 0,5-1 × 10⁶ células e centrifugue a 800 × g por 5 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e conservar o sedimento celular a -80 °C para extração de ADN genómico.
4. Adicione as células em placas de 96 poços na densidade de 1 × 10⁴ células por poço. Faça seis poços replicados para cada grupo. Adicione 100 μL de PBS estéril a um círculo de poços ao redor dos poços onde as células são semeadas. Incubar por 0, 24, 48 e 72 h.
5. Aspire cuidadosamente o meio da placa de 96 poços no ponto de tempo correspondente. Adicione 110 μL de meio contendo 1/10 de volume de CCK-8 aos poços. Configure um grupo em branco (apenas médio e CCK-8, sem células). Incubar na incubadora por 1 h.
6. Ler o valor de absorvância de 450 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas.
7. Use software estatístico para analisar os dados experimentais e expresse os dados experimentais como média ± desvio padrão (média ± DP). Analise as diferenças entre os dois grupos usando o teste t para amostras independentes, com P < 0,05 indicando uma diferença estatisticamente significativa.

6. Verificação de edição de genes (5 a 7 dias)

1. Extraia o DNA genômico (etapa 5.3) usando um kit de purificação de DNA genômico de acordo com as recomendações do fabricante.
2. Projete primers que amplificam a região de 200 a 500 pb centrada em torno do local de corte do sgRNA (Tabela 5).
3. Para a sequenciação de Sanger, preparar a mistura como no quadro 6 para a PCR. Amplificar os fragmentos do gene alvo utilizando um termociclador da seguinte forma: 95 °C durante 5 min, 40 ciclos (95 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, 72 °C durante 9 s), 72 °C durante 10 min, 4 °C ∞.
   NOTA: A edição de genes também pode ser verificada usando sequenciamento de próxima geração (NGS), e o produto de PCR precisa ser purificado usando um kit de purificação para NGS.
4. Analise os resultados do sequenciamento de Sanger no site do TIDE (http://tide.nki.nl). Calcule a eficiência de edição do sgRNA inserindo a sequência de sgRNA e os resultados do sequenciamento dos grupos experimental e de controle nesta ferramenta online.
   NOTA: Analise os resultados do NGS usando CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷. Insira leituras de extremidade emparelhada (dois arquivos) ou leituras de extremidade única (arquivo único) no formato fastq ou fastq.gz de um experimento de sequenciamento profundo, juntamente com uma sequência de referência e uma sequência de sgRNA. O software avaliará e quantificará a mutagênese direcionada.

Resultados

Efeito do nocaute de Trp53 na capacidade proliferativa de HSPCs de camundongos
Aqui, usamos o nocaute Trp53 como exemplo para demonstrar esse protocolo. Para investigar o efeito do nocaute de Trp53 na capacidade proliferativa de HSPCs de camundongos, empregamos transfecção lentiviral para introduzir o sgRNA de Trp53 em células da medula óssea que expressam Cas9 enriquecidas para HSPCs após o t...

Discussão

A tecnologia CRISPR/Cas9 tem sido amplamente utilizada em pesquisas biomédicas devido à sua natureza amigável e alta eficiência, facilitando aplicações como triagem de função gênica¹⁸, modelagem de doenças¹⁹, imunoterapia²⁰ e marcação e imagem de células vivas²¹. Estudos recentes conduziram triagem CRISPR em larga escala para identificar novos alvos terapêuticos em vários tipos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm microfiltration membrane	Sartoriu	16533K-1
1.5 mL EP tube	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
10 cm dish	Corning	430167
15 mL Tube	LABLEAD	LXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)	Accurate Biology	AG11010	For colony PCR
50 mL Tube	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracil	Sigma	F6627-1
6-well plate	Corning	3516
70 µm cell sieve	Falcon®	352350
96-well plates	Corning	3599
ACK Lysis Buffer	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicillin	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCR	Thermofisher
Cell Counting Kit-8	Bimake	B34304
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
Esp3I (BsmbI)	NEB	R0580L
Fetal Bovine Serum	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC;Virginia,USA
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	backbone vector
LSL-Cas9 mice	Model Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY	T002249
microplate absorbance spectrophotometer	BIO-RAD	xMark™
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Regular agarose	BIOWEST	BY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spectrophotometer	MOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cells	BioMed	BC108-01
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology	CBP50079
YEAST EXTRACT	OXOID	LP0021