CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

요약

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

조혈모세포는 장기적인 자가 재생 능력과 다양한 유형의 성숙한 혈액 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 조혈모세포(HSPC)에 암 돌연변이가 축적되면 정상적인 분화를 차단하고 비정상적인 증식을 유도하여 궁극적으로 백혈병 발생을 유발할 수 있습니다. 암 돌연변이를 확인 및/또는 평가하기 위해 CRISPR/Cas9 기술과 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 분석을 통합하여 HSPC의 비정상적인 증식 능력에 필수적인 모델 유전자 Trp53을 조사했습니다.구체적으로, Cas9 마우스에서 HSPC를 위해 농축된 골수 세포를 수확한 다음 하나 또는 여러 후보 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 바이러스 transfection을 수행하여 HSPC에 유전적 변형을 도입했습니다. 그런 다음 형질주입된 HSPC의 증식 능력을 조사하기 위해 CCK-8 분석을 수행했습니다. sgRNA 표적화 효율은 분해 분석에 의한 Indels 추적에 의해 확인되었습니다. 이렇게 확인된 유전자는 백혈병 발생에 중요한 역할을 할 수 있으며 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다.

서문

일생 동안 모든 혈통의 혈액 세포를 생산하는 조혈은 조혈 줄기 세포(HSC)라고 하는 작은 집단에 의해 유지됩니다. HSC는 자가 재생에 의해 스스로를 유지하고 완전히 분화된 기능적 혈액 세포를 생성하는 다양한 헌신적인 전구 세포를 생산합니다 ^1,2,3. 이 프로세스는 엄격하게 규제됩니다. 그러나 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에 암 돌연변이가 축적되면 정상적인 분화를 방해하고 비정상적인 증식 능력을 부여하며 궁극적으로 HSPC를 백혈병 개시 세포(LIC)로 변형시킵니다4,5,6,7. 백혈병 돌연변이를 식별하고 확인하는 것은 여전히 암 연구의 큰 과제로 남아 있습니다.

최근에는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시스템이 개발되어 Cas9 nuclease와 single-guide RNA(sgRNA)⁸로 구성된 효율적이고 정밀한 유전자 편집 방법이 되었습니다. sgRNA는 RNA-DNA 상보성을 통해 Cas9-sgRNA 복합체를 특정 게놈 위치로 안내하며, 여기서 Cas9 nuclease는 double-strand breaks를 유도합니다. 깨진 DNA는 상동성 주형이 있는 상태에서 정밀한 상동성 지향 복구 또는 불일치가 발생하기 쉬운 비상동성 말단 결합을 통해 내인성 유전자 편집 메커니즘의 적용을 받으며, 이로 인해 작은 삽입 또는 결실이 발생합니다⁹. 현재 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 유전자 편집 및 전사 조절¹⁰을 위한 강력한 도구가 되었습니다.

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술을 활용하여 HSPC에 유전적 변형을 도입한 다음 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 분석을 수행하여 도입된 돌연변이가 HSPC의 비정상적인 증식에 중요한지 여부를 조사했습니다.구체적으로, HSPC를 위해 농축된 골수 세포를 Cas9 마우스에서 수확한 후 후보 유전자를 표적으로 하는 sgRNA로 바이러스 transfection을 수행했습니다. 그런 다음, CCK-8 분석을 수행하여 돌연변이가 형질주입된 HSPC에 증가된 증식 능력을 부여하는지 여부를 확인했습니다. 마지막으로, CRISPR/Cas9에 의해 도입된 돌연변이는 TIDE(Tracking of Indels by Decomposition)¹¹ 또는 targeted deep sequence¹²에 의해 확인되었습니다. 이 프로토콜은 백혈병에 대한 암 돌연변이와 잠재적인 치료 표적을 평가하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 베이징 중의과 대학의 동물 관리 및 복지 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 후보 유전자를 타겟하는 sgRNA plasmid 구축 (4 - 5일)

1. 온라인 sgRNA 디자인 도구를 사용하여 타겟 sgRNA를 설계합니다. 타겟 게놈 DNA 염기서열을 온라인 sgRNA 설계 도구(예: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)에 입력합니다. 적절한 sgRNA target을 선택하고 필요한 oligonucleotide를 주문합니다.
2. sgRNA oligo insert를 준비합니다. 각 sgRNA에 대해 설계된 올리고의 상단 및 하단 가닥을 100μM의 최종 농도로 재현탁(단계 1.1)합니다.sgRNA 올리고를 인산화 및 어닐링하기 위해 표 1 에 따라 혼합물을 준비합니다. 다음 열순환 매개변수를 사용하십시오: 30분 동안 37°C; 95 분 동안 5 °C; 최소 5°C에서 25°C까지 경사로⁻¹.
3. 1 μL의 인산화 및 어닐링된 올리고를 199 μL의 실온 ddH₂O에 첨가하여 1:200의 희석 비율을 달성합니다.
4. 벡터 플라스미드를 선형화합니다.
   1. 참조된 backbone 벡터( Table of Materials) 를 사용하여 제한 효소 Esp3I(BsmBI)를 사용하여 벡터 플라스미드를 분해합니다. 표 1 에 따라 반응을 설정하고 55°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 동일한 튜브에 0.5 μL의 Shrimp Alkaline Phosphatase(rSAP)를 추가하고 37 °C에서 30분 동안 배양하여 선형 플라스미드의 자동 접합 가능성을 줄입니다.
   3. 성공적인 선형화를 확인합니다. 전기영동을 위해 선형화된 플라스미드와 절단되지 않은 플라스미드를 0.8-1%(w/v) 아가로스 겔에 로드합니다.
   4. PCR purification kit로 선형화된 플라스미드를 정제하고, 20 μL의 ddH₂O를 용리하고, DNA 농도를 정량화합니다.
5. 표 1에 따라 각 sgRNA에 대한 ligation reaction을 설정하여 sgRNA oligo를 벡터 plasmid로 clone합니다. 16 ° C에서 4 시간 동안 배양하십시오.
6. 형질전환을 위해 1.5단계의 생성물 10μL를 얼음처럼 차갑게 사용할 수 있는 Stbl3 세포 50μL에 첨가하고 혼합물을 얼음에서 30분 동안 배양한 다음 42°C에서 90초 동안 열 충격을 가한 다음 즉시 2분 동안 얼음에 다시 넣습니다. 동일한 튜브에 200μL의 무항생제 LB 배지를 추가하고 37°C에서 30분 동안 220rpm으로 흔든 다음 100μg/mL 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 플레이트합니다. 플레이트를 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
7. 다음 날, 군체가 자랐는지 판을 검사하십시오. 각 플레이트에서 6-8개의 콜로니를 선택하고 콜로니 PCR을 사용하여 sgRNA가 올바르게 삽입되었는지 확인합니다. 양성 콜로니를 선택하고 멸균 피펫 팁을 사용하여 100μg/mL 암피실린이 함유된 5mL의 LB 배지에 개별 콜로니를 접종합니다. 배양물을 37°C에서 하룻밤 동안 배양하고 흔듭니다.
8. 미니 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 배양물에서 플라스미드 DNA를 분리합니다. 6-nt 가이드 시퀀스가 올바르게 삽입되었는지 확인하기 위해 U20 프로모터의 시퀀스.

2. 렌티바이러스 포장(2 - 3일)

1. 37°C 및 5%_CO2에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신 용액이 보충된 DMEM 배지에서 HEK 293T 세포를 배양합니다.
2. 페트리 접시에서 오래된 배지를 흡인하여 HEK293T 세포를 통과시키고 접시를 PBS 3mL로 2x 부드럽게 씻습니다. 10cm 접시에 트립신 1mL를 넣고 37°C에서 1분 동안 배양합니다. 따뜻한 DMEM 배지 3mL를 접시에 넣어 트립신을 비활성화하고, 세포를 15mL 튜브에 모은 다음 800×g에서 5 분 동안 회전 합니다. 상등액을 버리고, 5mL의 배지에 세포를 재현탁하고, 필요에 따라 세포를 새 접시에 플레이트화합니다.
   참고: 렌티바이러스 생산을 위해 10개 미만의 계대를 가진 HEK 293T 세포를 사용하십시오.
3. 형질주입 16-24시간 전에 HEK293T 세포를 접시당 2-4 × 10⁶ 세포의 밀도로 10cm 접시에 파종합니다. 사용된 DMEM에 항생제가 없는지 확인합니다.
4. transfection 당일에 세포가 70-80% 융합되어 있는지 확인합니다. 10cm 접시 당 10-15 μg의 플라스미드를 변형시키고 플라스미드와 PEI의 몰 비율을 1 : 3으로 유지하십시오. 표 2에 따라 형질주입을 위해 Mix 1 및 Mix 2를 준비합니다.
5. Mix 2를 5분 동안 그대로 둡니다. Mix 2를 Mix 1에 추가하고(추가 순서가 바뀌지 않도록 주의) 철저히 혼합한 다음 15-20분 동안 그대로 둡니다.
6. 세포에 복합체(2.5단계)를 추가하고, 접시를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다. 6-8시간 후에 배지를 DMEM 배지(10% FBS 함유)로 교체합니다.
7. 렌티바이러스 형질주입 시작 2일 후, 접시에서 렌티바이러스 상등액을 모읍니다. 4,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 가열하고 0.45 μm 미세여과막을 통해 여과합니다. 렌티바이러스를 분주하고 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 수집된 렌티바이러스는 필요에 따라 농축될 수 있습니다. 반복적인 동결 및 해동으로 인한 바이러스 역가를 감소시키지 마십시오.

3. 골수 세포 추출 및 배양 (12 - 13일)

참고: 모든 마우스 라인은 순수한 C57BL/6 유전적 배경에서 유지되었습니다. LSL-Cas9 마우스(T002249)를 Mx1-Cre 마우스¹³ 과 교배하여 LSL-Cas9/+를 생성했습니다. Mx1-Cre / + 마우스. 여기에서는 Mx1-Cre/+에서 골수 세포를 수집했습니다. LSL-Cas9/+ 생쥐와 그 새끼.

1. Cre recombinase의 발현을 유도하기 위해 1일차와 3일차에 150μL의 폴리이노신-폴리시티딜릭(1.5mg/mL)을 마우스(8-12주령)에게 복강내로 주입합니다. 6일째에 마우스에 5-플루오로우라실(5-FU, 150mg/kg)을 복강내 주사합니다.
   참고: Mx1-Cre 형질전환 마우스는 유도성 Mx1 프로모터¹³의 제어 하에 Cre 재조합효소를 발현하도록 설계되었습니다. 폴리이노신-폴리시티딜릭의 복강내 주사는 Mx1 프로모터를 효과적으로 활성화하고 Cre 재조합효소 발현을 유도할 수 있습니다¹⁴. 5-FU의 주사는 골수에서 증식하는 세포를 고갈시키는 데 사용되며, 이에 따라 HSC가 세포주기에 진입하도록 유도하고 HSPC의 상대적 풍부함을 초래합니다¹⁵. 5-FU 치료 후 마우스 당 약 2-4 × 10⁶ 개의 골수 세포를 수확 할 수 있습니다.
2. 11일째에 CO₂ 질식으로 마우스를 희생합니다. 마우스의 대퇴골과 경골을 취하여 1mL 멸균 주사기를 사용하여 2% FBS가 포함된 PBS로 골수강을 세척하고 Gavrilescu et ^al.16에 설명된 대로 골수 세포를 수집합니다.
   참고: 골수 세포를 채취하는 동안 무균 상태를 유지하기 위해 마우스에서 경골과 비골을 제거하는 즉시 뼈를 층류 후드로 옮깁니다.
3. 골수 세포를 위아래로(30-50x) 피펫하여 단일 세포로 분산시킨 다음 세포 혼합물을 50mL 튜브에 옮기고 잘 섞이도록 소용돌이칩니다.
4. 10μL의 세포 현탁액을 40μL의 적혈구 용해 완충액에 추가하고 적혈구가 용해되도록 5분 동안 얼음에 놓습니다. 트리판 블루 용액 50μL를 넣고 잘 섞은 후 생존 가능한 세포를 계수합니다.
5. 800 × g 에서 4 °C에서 15 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 상층액을 흡인합니다.
6. 표 3에 설명된 바와 같이 골수 사전 자극 배지에서 1-2 ×^{10 6} cells/mL로 세포를 재현탁합니다. 10cm 접시, 10mL/플레이트에 세포를 파종하고 24시간 동안 배양합니다.

4. 골수 세포의 렌티바이러스 형질주입(2 - 3일)

1. 다음 날, 자극된 플레이트에서 세포를 수집합니다. 2% FBS가 함유된 PBS 5--10mL로 플레이트를 세게 헹굽니다. 3.4단계에서 설명한 대로 trypan blue를 추가하여 사용 가능한 세포를 계산합니다.
2. 실온에서 800 × g 으로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 표 4에 설명된 대로 바이러스 감염 용액을 준비합니다.
3. 상층액을 버리고 갓 준비한 감염액(∼10,⁶ cells/mL)에 세포를 재현탁합니다. 부유 세포를 웰당 4mL의 6웰 플레이트에 파종합니다. 파라필름으로 6웰 플레이트를 밀봉하고 1,500× g 에서 32°C에서 90분 동안 플레이트를 원심분리합니다.
4. 원심분리 후 피펫으로 세포를 부드럽게 재현탁시킨 다음(배지는 변경하지 않음) 인큐베이터에서 4-6시간 동안 플레이트를 배양합니다.
5. 첫 번째 transfection의 경우, 각 웰(~3mL)에서 가능한 한 많은 상층 액을 조심스럽게 흡인하고 동일한 부피의 골수 전치 자극 배지를 추가합니다. 시술 중 일부 세포가 실수로 흡인된 경우 실온에서 800 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 소량의 프리스티뮬레이션 배지로 세포를 재현탁한 다음 웰에 다시 첨가합니다.
6. 2차 형질주입의 경우, 다음날 각 웰에서 2-3mL의 배지를 제거하고 표 4에 설명된 대로 적절한 양의 HEPES 및 폴리브레네와 함께 동일한 부피의 갓 해동된 레트로바이러스 원액을 첨가합니다. 플레이트를 1,500 × g 에서 90분, 37 °C에서 원심분리합니다.
7. 원심분리 후 세포를 부드럽게 재현탁시키고 4-6시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 계속 배양합니다.
8. 4.5단계와 같이 매체를 교체합니다. 24시간 동안 배양합니다.

5. in vitro CCK-8 assay 수행 (3 - 4일)

1. 골수 세포를 채취하기 위해 우물을 세게 헹굽니다. 최대 세포 수를 얻기 위해 2% FBS가 포함된 PBS로 플레이트를 세척합니다. 70μm 체를 통해 세포를 여과하고 3.4단계에서 설명한 대로 trypan blue로 생존 가능한 세포를 계산합니다.
2. 실온에서 800 × g 으로 10분 동안 세포를 원심분리합니다.
3. 10% FBS 및 mIL-3, mIL-6(10ng/mL), mSCF(100ng/mL)를 1 × 10⁵ cells/mL로 포함하는 DMEM으로 세포를 재현탁합니다. ~0.5-1 × 10⁶ 세포를 취하고 실온에서 5분 동안 800 × g 에서 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠렛을 -80°C에서 보관하여 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
4. 세포를 웰당 1 × 10⁴ 개 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 추가합니다. 각 그룹에 대해 6개의 복제 우물을 만듭니다. 100μL의 멸균 PBS를 세포가 파종되는 웰 주변의 웰 원형에 추가합니다. 0, 24, 48, 72시간 동안 배양합니다.
5. 해당 시점에서 96웰 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입합니다. CCK-8의 1/10 부피를 함유하는 배지 110μL를 웰에 추가합니다. 빈 그룹을 설정합니다(중간 및 CCK-8만, 셀 없음). 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 450nm 흡광도 값을 판독합니다.
7. 통계 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 분석하고 실험 데이터를 평균 ± 표준 편차(평균 ± SD)로 표현합니다. 독립 표본 t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 분석하며, P < 0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다.

6. 유전자 편집 확인 (5 - 7일)

1. 제조업체의 권장 사항에 따라 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다(5.3단계).
2. sgRNA 절단 부위를 중심으로 200-500-bp 영역을 증폭하는 설계 프라이머(표 5).
3. Sanger 염기서열분석을 위해, PCR에 대해 표 6 과 같이 혼합물을 준비한다. 다음과 같이 thermocycler를 사용하여 표적 유전자 단편을 증폭하십시오 : 95 °C 5 분, 40 사이클 (95 °C 30 초, 58 ° C 30 초, 72 ° C 9 초), 72 ° C 10 분, 4 ° C ∞.
   참고: 유전자 편집은 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 검증할 수도 있으며, PCR 산물은 NGS용 정제 키트를 사용하여 정제해야 합니다.
4. TIDE 웹사이트(http://tide.nki.nl)에서 Sanger 염기서열분석 결과를 분석합니다. 이 온라인 도구에 sgRNA 염기서열과 실험 그룹과 대조군 모두의 염기서열분석 결과를 입력하여 sgRNA의 편집 효율성을 계산하십시오.
   참고: CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)¹⁷을 사용하여 NGS 결과를 분석합니다. reference sequence 및 sgRNA sequence와 함께 deep sequencing 실험에서 fastq 또는 fastq.gz 형식의 paired-end read(파일 2개) 또는 single-end read(단일 파일)를 입력합니다. 이 소프트웨어는 표적 돌연변이 유발을 평가하고 정량화합니다.

결과

Trp53 knockout이 마우스 HSPC의 증식 능력에 미치는 영향
여기에서는 이 프로토콜을 보여주기 위해 Trp53 녹아웃을 예로 사용했습니다. Trp53 knockout이 마우스 HSPC의 증식 능력에 미치는 영향을 조사하기 위해 렌티바이러스 transfection을 사용하여 5-FU 처리 후 HSPC가 풍부한 Cas9 발현 골수 세포에 Trp53 sgRNA를 도입했?...

토론

CRISPR/Cas9 기술은 유전자 기능 스크리닝(gene function screening⁾¹⁸, 질병 모델링(disease modeling⁾¹⁹, 면역요법(immunotherapy)²⁰, 생세포 라벨링 및 이미징(live cell labeling and screening⁾²¹과 같은 응용을 용이하게 하는 사용자 친화적이고 높은 효율성으로 인해 생물의학 연구에 널리 사용되어 왔습니다. 최근 연구에서는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm microfiltration membrane	Sartoriu	16533K-1
1.5 mL EP tube	LABLEAD	MCT-150-CLD-1
10 cm dish	Corning	430167
15 mL Tube	LABLEAD	LXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)	Accurate Biology	AG11010	For colony PCR
50 mL Tube	LABLEAD	LXG5000
5-Fluorouracil	Sigma	F6627-1
6-well plate	Corning	3516
70 µm cell sieve	Falcon®	352350
96-well plates	Corning	3599
ACK Lysis Buffer	Leagene	CS0001
Agar	BIODEE	DE0010
Ampicillin	Solarbio	A8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCR	Thermofisher
Cell Counting Kit-8	Bimake	B34304
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC
DMEM	Gibco	C11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5	ZYMO	D4014
Dneasy Blood & Tissure Kit	Qiagen	69504
Esp3I (BsmbI)	NEB	R0580L
Fetal Bovine Serum	ExCell	FSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293T	ATCC;Virginia,USA
HEPEs	Sigma	V900477
KOD-Plus-Neo	TOYOBO	KOD-401
lentiGuide-Puro	Addgene	52963	backbone vector
LSL-Cas9 mice	Model Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY	T002249
microplate absorbance spectrophotometer	BIO-RAD	xMark™
Nacl	Rhawn	R019772
PBS	Solarbio	P1003
PEI	Proteintech	B600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Solarbio	P1400
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
polybrene	Beyotime	C0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt	Sigma	P1530
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
RecombinantMurineIL-3	Peprotech	213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6	Peprotech	216-16-2ug
RecombinantMurineSCF	Peprotech	250-03-10ug
Regular agarose	BIOWEST	BY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spectrophotometer	MOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cells	BioMed	BC108-01
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201L
T4-Ligase	Takara	2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP105-03
Trypan Blue solution	LABLEAD	C0040-100ml
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Tryptone	OXOID	LP0042
WEHI-CM	Nanjing Fuksai Biotechnology	CBP50079
YEAST EXTRACT	OXOID	LP0021