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要約

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイを統合して、造血幹細胞および前駆細胞の異常な増殖能力に重要な候補遺伝子を同定するプロトコールを紹介します。

要約

造血幹細胞は、長期にわたる自己複製能力と、様々な種類の成熟血液細胞に分化する可能性を秘めています。しかし、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)にがん性変異が蓄積すると、正常な分化が妨げられ、異常な増殖が誘発され、最終的には白血病原生につながる可能性があります。がん性変異を同定および/または評価するために、CRISPR/Cas9技術をCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイと統合して、HSPCの異常な増殖能力に不可欠なモデル遺伝子Trp53を調査しました。具体的には、Cas9マウスのHSPCに富む骨髄細胞を採取し、HSPCに遺伝子変異を導入するために、1つまたは複数の候補遺伝子を標的とするシングルガイドRNA(sgRNA)によるウイルストランスフェクションを行いました。次に、トランスフェクションされたHSPCの増殖能力を調べるために、CCK-8アッセイを実施しました。sgRNAのターゲティング効率は、分解アッセイによるIndelsの追跡によって確認されました。これらの同定された遺伝子は、白血病発生に重要な役割を果たしている可能性があり、潜在的な治療標的として機能する可能性があります。

概要

造血は、生涯を通じてすべての血球系統を産生し、造血幹細胞(HSC)と呼ばれる小さな集団によって維持されています。造血幹細胞は自己複製によって自己を維持し、完全に分化した機能的な血液細胞を生じさせるさまざまな献身的な前駆細胞を産生します1,2,3。このプロセスは厳しく規制されています。しかし、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)における癌性変異の蓄積は、正常な分化を妨げ、異常な増殖能力を与え、最終的にHSPCを白血病開始細胞(LIC)に変換します4,5,6,7。白血病原性変異の同定と確認は、がん研究にとって依然として大きな課題です。

近年、Cas9ヌクレアーゼとシングルガイドRNA(sgRNA)8からなる、クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)システムを開発し、効率的で精密な遺伝子編集法となった。sgRNAは、RNA-DNA相補性を通じてCas9-sgRNA複合体を特定ゲノム位置に誘導し、Cas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導します。壊れたDNAは、相同性テンプレートの存在下での正確な相同性指向修復、またはミスマッチを起こしやすい非相同末端結合のいずれかを通じて、内因性の遺伝子編集メカニズムにさらされ、これにより小さな挿入または欠失が生じる9。現在、CRISPR/Cas9システムは、標的遺伝子編集および転写制御のための強力なツールとなっています10。

ここでは、CRISPR/Cas9技術を用いてHSPCに遺伝子変異を導入し、その後、Cell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイを実施して、導入された変異がHSPCの異常な増殖に重要であるかどうかを調べました。具体的には、HSPCに富む骨髄細胞をCas9マウスから採取した後、候補遺伝子を標的とするsgRNAをウイルストランスフェクションしました。次に、CCK-8アッセイを実施して、変異がトランスフェクションされたHSPCに増殖能力の増加をもたらしたかどうかを判断しました。最後に、CRISPR/Cas9によって導入された変異は、Tracking of Indels by Decomposition(TIDE)11 または標的深部配列12によって確認されました。このプロトコルは、がん性変異と白血病の潜在的な治療標的を評価するための強力なツールを提供します。

プロトコル

この議定書に基づいて実施されたすべての動物実験は、北京中医薬大学の動物管理福祉委員会によって承認されました。

1. 候補遺伝子を標的としたsgRNAプラスミドの構築(4〜5日)

  1. オンラインのsgRNA設計ツールを使用して、標的となるsgRNAを設計します。標的ゲノムDNA配列をオンラインのsgRNAデザインツール(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public など)に入力します。適切なsgRNAターゲットを選択し、必要なオリゴヌクレオチドを注文してください。
  2. sgRNAオリゴインサートを調製します。各sgRNAについて、設計したオリゴのトップストランドとボトムストランドを再懸濁し(ステップ1.1)、最終濃度100 μMまで戻します。 表1 に従って混合物を調製し、sgRNAオリゴをリン酸化し、アニールします。次の熱サイクルパラメータを使用します:37°Cで30分間。95°Cで5分間;5°Cmin-1で25°Cまで下げます。
  3. リン酸化およびアニーリングされたオリゴ1 μLを室温のddH2O199 μLに加えて、1:200の希釈比を達成します。
  4. ベクタープラスミドを線形化します。
    1. 参照されているバックボーンベクター( 材料表を参照)を使用して、制限酵素Esp3I(BsmBI)を使用してベクタープラスミドを消化します。 表1 に従って反応液を調製し、55°Cで1時間インキュベートします。
    2. 0.5 μLのShrimp Alkaline Phosphatase(rSAP)を同じチューブに添加し、37°Cで30分間インキュベートして、線状プラスミドの自動結合の可能性を減らします。
    3. 線形化が成功したことを確認します。直鎖状プラスミドとアンカットプラスミドを電気泳動用にロードし、0.8-1%(w/v)アガロースゲルにロードします。
    4. 直鎖状プラスミドをPCR精製キットで精製し、20 μLのddH2Oで溶出し、DNA濃度を定量します。
  5. 表1に従って各sgRNAのライゲーション反応を設定することにより、sgRNAオリゴをベクタープラスミドにクローニングします。16°Cで4時間インキュベートします。
  6. 形質転換には、ステップ1.5の産物10 μLを50 μLの氷冷コンピテントStbl3細胞に加え、混合物を氷上で30分間インキュベートし、42°Cで90秒間ヒートショックを与えた後、速やかに氷に2分間戻します。200 μL の抗生物質フリー LB 培地を同じチューブに加え、220 rpm で 37 °C で 30 分間振とうした後、100 μg/mL のアンピシリンが入った LB プレートにプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
  7. 翌日、プレートのコロニーの成長を調べます。各プレートから6〜8コロニーを選択し、コロニーPCRを使用してsgRNAが正しく挿入されるかどうかを確認します。陽性コロニーを選択し、滅菌ピペットチップを使用して、100 μg/mL アンピシリンを含む 5 mL の LB 培地に個々のコロニーを接種します。培養物をインキュベートし、37°Cで一晩振とうします。
  8. ミニプラスミドDNA精製キットを使用して、培養物からプラスミドDNAを単離します。U6プロモーターからのシーケンスで、20-ntガイドシーケンスが正しく挿入されていることを確認します。

2. レンチウイルス包装(2〜3日)

  1. 10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を添加したDMEM培地でHEK 293T細胞を37°Cおよび5%CO2で培養します。
  2. ペトリ皿から古い培地を吸引してHEK293T細胞を継代し、3mLのPBSで皿を2回穏やかに洗浄します。10 cmの皿に1 mLのトリプシンを加え、37°Cで1分間インキュベートします。3 mLの温かいDMEM培地を皿に加えてトリプシンを不活性化し、細胞を15 mLのチューブに集め、800 × g で5分間回転させます。上清を捨て、細胞を5 mLの培地に再懸濁し、必要に応じて細胞を新しい皿にプレートします。
    注:レンチウイルスの産生には、継代数が10未満のHEK 293T細胞を使用してください。
  3. トランスフェクションの16〜24時間前に、HEK293T細胞を10cmのディッシュに、ディッシュあたり2〜4〜10個の6 細胞の密度で播種×。使用するDMEMが抗生物質を含まないことを確認してください。
  4. トランスフェクションの日に細胞が70〜80%コンフルエントであることを確認してください。10 cmディッシュあたり10〜15 μgのプラスミドを形質転換し、プラスミドとPEIのモル比を1:3に保ちます。 表2に従って、トランスフェクション用のMix 1とMix 2を調製します。
  5. ミックス2を5分間放置し、ミックス1にミックス2を加え(加える順番を逆にしないように注意)、よく混ぜてから15〜20分間放置します。
  6. 複合体(ステップ2.5)を細胞に加え、皿を静かに振って混合し、37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートします。6〜8時間後、培地をDMEM培地(10%FBSを含む)と交換します。
  7. レンチウイルストランスフェクション開始の2日後に、皿からレンチウイルス上清をプールします。4,000 g× g 、4°Cで10分間遠心分離し、0.45 μmの精密ろ過メンブレンでろ過します。レンチウイルスを分注し、-80°Cで保存します。
    注:収集されたレンチウイルスは、必要に応じて濃縮できます。凍結と解凍を繰り返すことによるウイルス力価の低下は避けてください。

3. 骨髄細胞の抽出と培養(12〜13日)

注:すべてのマウス系統は、純粋なC57BL/6遺伝的背景で維持されました。LSL-Cas9マウス(T002249)をMx1-Creマウス13 と交配してLSL-Cas9/+を作製した;Mx1-Cre/+マウス。ここでは、Mx1-Cre / +から骨髄細胞を採取しました。LSL-Cas9/+マウスとその同腹仔。

  1. Creリコンビナーゼの発現を誘導するには、マウス(8〜12週齢)に1日目と3日目に150μLのポリイノシン-ポリシチジル酸(1.5 mg / mL)を腹腔内に注射します。.6日目に、マウスに5-フルオロウラシル(5-FU、150 mg / kg)を腹腔内注射します。.
    注:Mx1-Creトランスジェニックマウスは、誘導性Mx1プロモーター13の制御下でCreリコンビナーゼを発現するように操作されています。ポリイノシン-ポリシチジルの腹腔内注射は、Mx1プロモーターを効果的に活性化し、Creリコンビナーゼ発現を誘導することができます14。5-FUの注射は、骨髄内の増殖細胞を枯渇させるために利用され、それによってHSCが細胞周期に入るように誘導され、その結果、HSPCが相対的に豊富に存在します15。5-FU処理後、マウス1匹あたり約2-4個×10個6 個の骨髄細胞を採取することができます。
  2. 11日目に、CO2 窒息によってマウスを犠牲にします。マウスの大腿骨と脛骨を採取し、1mLの滅菌シリンジを使用して2%FBSを含むPBSで骨髄腔を洗い流し、Gavrilescuら16で説明されているように骨髄細胞を採取します。
    注:骨髄細胞の収集中に無菌性を維持するために、脛骨と腓骨がマウスから取り除かれたらすぐに骨を層流フードに移します。
  3. 骨髄細胞を上下(30〜50倍)にピペットで動かして単一細胞に分散させ、細胞混合物を50mLチューブに移し、ボルテックスしてよく混合します。
  4. 10 μLの細胞懸濁液を40 μLの赤血球溶解バッファーに加え、氷上に5分間置いて赤血球を溶解させます。トリパンブルー溶液50μLを加え、よく混合し、生細胞をカウントします。
  5. 細胞を800 × g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を吸引します。
  6. 表3に記載されているように、細胞を骨髄前刺激培地に1〜2×106細胞/ mLで再懸濁します。細胞を10 cm皿(10 mL/プレート)に播種し、24時間インキュベートします。

4. レンチウイルスによる骨髄細胞へのトランスフェクション(2〜3日)

  1. 翌日、刺激されたプレートから細胞を採取します。2%FBSを含む5〜10mLのPBSでプレートを激しくすすいでください。ステップ3.4で説明したようにトリパンブルーを添加して、生細胞をカウントします。
  2. 細胞を800 × g で室温で10分間遠心分離します。 表4の説明に従ってウイルス核感染溶液を調製します。
  3. 上清を廃棄し、新たに調製した胞子感染溶液(約106 細胞/ mL)に細胞を再懸濁します。.懸濁細胞を6ウェルプレート(ウェルあたり4 mL)に播種します。6ウェルプレートをパラフィルムで密封し、プレートを1,500 × g で32°Cで90分間遠心分離します。
  4. 遠心分離後、ピペットで細胞を穏やかに再懸濁し(ただし、培地は交換しないでください)、プレートをインキュベーター内で4〜6時間インキュベートします。
  5. 最初のトランスフェクションでは、各ウェルからできるだけ多くの上清培地(~3 mL)を慎重に吸引し、等量の骨髄前刺激培地を加えます。処置中に一部の細胞が誤って吸引された場合は、室温で800 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、少量の前刺激培地で細胞を再懸濁し、ウェルに戻します。
  6. 二次トランスフェクションについては、翌日、各ウェルから2〜3 mLの培地を取り出し、 表4に記載されているように、同量の解凍したばかりのレトロウイルスストック溶液を、適切な量のHEPESおよびポリブレンとともに加えます。プレートを1,500 × g で90分間、37°Cで遠心分離します。
  7. 遠心分離後、細胞を穏やかに再懸濁し、インキュベーター内でプレートを4〜6時間インキュベートし続けます。
  8. 手順4.5のようにメディアを交換します。24時間インキュベートします。

5. in vitro CCK-8アッセイの実施(3〜4日)

  1. 骨髄細胞を採取するためにウェルを激しくすすぎます。2% FBSを含むPBSでプレートを洗浄し、最大数の細胞を取得します。70 μmのふるいで細胞をろ過し、ステップ3.4で説明したようにトリパンブルーで生細胞をカウントします。
  2. 細胞を800 × g で室温で10分間遠心分離します。
  3. 10% FBS と mIL-3、mIL-6 (10 ng/mL)、mSCF (100 ng/mL) を含む DMEM で細胞を 1 × 105 細胞/mL に再懸濁します。~0.5-1 × 10個の 6 細胞を取り込み、800 × g で室温で 5 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを-80°Cで保存してゲノムDNAを抽出します。
  4. 細胞をウェルあたり1個×10個の4 個の細胞の密度で96ウェルプレートに加えます。各グループに対して 6 つのレプリケートウェルを作成します。100 μLの滅菌PBSを、細胞が播種されているウェルの周りのウェルの輪に加えます。0時間、24時間、48時間、72時間インキュベートします。
  5. 対応する時点で96ウェルプレートから培地を慎重に吸引します。1/10容量のCCK-8を含む110 μLの培地をウェルに加えます。空白のグループを設定します(中程度とCCK-8のみ、セルなし)。インキュベーターで1時間インキュベートします。
  6. マイクロプレート分光光度計を使用して450nmの吸光度値を読み取ります。
  7. 統計ソフトウェアを使用して実験データを分析し、実験データを平均±標準偏差(平均±SD)として表します。独立サンプルの t検定を使用して2つのグループ間の差を分析し、P<0.05は統計的に有意な差を示します。

6. 遺伝子編集の検証(5〜7日)

  1. メーカーの推奨に従って、ゲノムDNA精製キットを使用してゲノムDNAを抽出します(ステップ5.3)。
  2. sgRNA切断部位を中心に200〜500 bpの領域を増幅するプライマーを設計します(表5)。
  3. サンガーシーケンシングの場合は、 PCR用に表6 のように混合物を調製します。サーモサイクラーを使用して、95°Cで5分間、40サイクル(95°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで9秒)、72°Cで10分間、4°C∞で、サーモサイクラーを使用して標的遺伝子断片を増幅します。
    注:遺伝子編集は次世代シーケンシング(NGS)を使用して検証することもでき、PCR産物はNGS用の精製キットを使用して精製する必要があります。
  4. TIDE の Web サイトで Sanger シーケンシング結果を解析します (http://tide.nki.nl)。このオンラインツールに、実験グループと対照グループの両方のsgRNA配列とシーケンシング結果を入力して、sgRNAの編集効率を計算します。
    注:CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17を使用してNGS結果を解析します。ディープシーケンシング実験からのFastqまたはfastq.gz形式のペアエンドリード(2ファイル)またはシングルエンドリード(シングルファイル)を、参照配列およびsgRNA配列とともに入力します。このソフトウェアは、標的変異誘発を評価し、定量化します。

結果

Trp53 ノックアウトがマウスHSPCの増殖能に及ぼす影響
ここでは、 Trp53 ノックアウトを例に、このプロトコルを実演しました。 Trp53 ノックアウトがマウスHSPCの増殖能に及ぼす影響を調べるために、レンチウイルストランスフェクションを用いて、5-FU処理後にHSPCに濃縮されたCas9発現骨髄細胞に Trp53 sg...

ディスカッション

CRISPR/Cas9技術は、そのユーザーフレンドリーな性質と高効率により、生物医学研究で広く使用されており、遺伝子機能スクリーニング18、疾患モデリング19、免疫療法20、生細胞の標識およびイメージング21などのアプリケーションを促進しています。最近の研究では、白血病22,23,24を含むさまざま...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究を完了するために共有サービスを利用してくださった北京中医薬大学に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会の若手科学者基金(J. ZhangのNo.31701280)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm microfiltration membraneSartoriu16533K-1
1.5 mL EP tubeLABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm dishCorning430167
15 mL TubeLABLEADLXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)Accurate BiologyAG11010For colony PCR
50 mL TubeLABLEADLXG5000
5-FluorouracilSigmaF6627-1
6-well plateCorning3516
70 µm cell sieveFalcon®352350
96-well platesCorning3599
ACK Lysis BufferLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpicillinSolarbioA8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCRThermofisher
Cell Counting Kit-8BimakeB34304
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5810R
CO2 IncubatorThermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5ZYMOD4014
Dneasy Blood & Tissure KitQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Fetal Bovine SerumExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC;Virginia,USA
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963backbone vector
LSL-Cas9 miceModel Animal
Research Center of
NANJING UNIVERSITY 		T002249
microplate absorbance spectrophotometerBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xSolarbioP1400
pMD2.G plasmidAddgene12259
polybreneBeyotimeC0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium saltSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen28104
RecombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RecombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Regular agaroseBIOWESTBY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro SpectrophotometerMOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cellsBioMedBC108-01 
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201L
T4-LigaseTakara2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid KitTIANGENDP105-03
Trypan Blue solutionLABLEADC0040-100ml
Trypsin-EDTAGibco25200072
TryptoneOXOIDLP0042
WEHI-CMNanjing Fuksai Biotechnology CBP50079
YEAST EXTRACTOXOIDLP0021

参考文献

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