JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, который интегрирует технологию CRISPR/Cas9 с анализом Cell Counting Kit-8 (CCK-8) для идентификации генов-кандидатов, которые имеют решающее значение для аномальной пролиферативной способности гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников.

Аннотация

Гемопоэтические стволовые клетки обладают способностью к долгосрочному самообновлению и потенциалом к дифференцировке в различные типы зрелых клеток крови. Тем не менее, накопление раковых мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (ГСК) может блокировать нормальную дифференцировку, индуцировать аберрантную пролиферацию и, в конечном итоге, привести к лейкемогенезу. Для идентификации и/или оценки раковых мутаций мы интегрировали технологию CRISPR/Cas9 с анализом Cell Counting Kit-8 (CCK-8) для исследования модельного гена Trp53, который необходим для аномальной пролиферативной способности HSPC. В частности, были собраны клетки костного мозга, обогащенные HSPC у мышей Cas9, а затем подвергнуты вирусной трансфекции с помощью однонаправляющих РНК (sgRNAs), нацеленных на один или несколько генов-кандидатов, чтобы внести генетические изменения в HSPC. Затем был проведен анализ CCK-8 для изучения пролиферативной способности трансфицированных ГСКФ. Эффективность нацеливания на sgRNA была подтверждена анализом Tracking of Indels by Decomposition. Эти идентифицированные гены могут играть решающую роль в лейкемогенезе и могут служить потенциальными терапевтическими мишенями.

Введение

Кроветворение, которое производит все линии клеток крови на протяжении всей жизни, поддерживается небольшой популяцией, называемой гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). ГСК поддерживают себя за счет самообновления и продуцируют различные коммитированные предшественники, которые дают начало полностью дифференцированным функциональным клеткам крови 1,2,3. Этот процесс жестко регламентирован. Тем не менее, накопление раковых мутаций в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках (ГСК) препятствует нормальной дифференцировке, придает аномальную пролиферативную способность и в конечном итоге превращает ГСКК в клетки, инициирующие лейкемию (КСЗ)4,5,6,7. Идентификация и подтверждение лейкемогенных мутаций по-прежнему остается большой проблемой для исследований рака.

Недавно была разработана система кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9), которая стала эффективным и точным методом редактирования генов, состоящим из нуклеазы Cas9 и однонаправляющей РНК (sgRNA)8. sgRNA направляет комплекс Cas9-sgRNA к определенному геномному месту через комплементарность РНК-ДНК, где нуклеаза Cas9 индуцирует двухцепочечные разрывы. Разрушенная ДНК подвергается эндогенным механизмам редактирования генов либо посредством точной репарации, направленной на гомологию, в присутствии гомологических шаблонов, либо подверженного несоответствию, негомологичного соединения концов, что приводит к небольшим вставкам или делециям9. В настоящее время система CRISPR/Cas9 стала мощным инструментом для целенаправленного редактирования генов и регуляциитранскрипции10.

В частности, мы использовали технологию CRISPR/Cas9 для введения генетических изменений в HSPC, а затем провели анализ Cell Counting Kit-8 (CCK-8), чтобы выяснить, имеют ли введенные мутации решающее значение для аномальной пролиферации HSPC. В частности, клетки костного мозга, обогащенные HSPC, были собраны у мышей Cas9 с последующей трансфекцией вируса sgРНК, нацеленными на гены-кандидаты. Затем был проведен анализ CCK-8, чтобы определить, придают ли мутации повышенную пролиферативную способность трансфицированным HSPC. Наконец, мутации, внесенные CRISPR/Cas9, были подтверждены с помощью Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)11 или целевой глубокой последовательности12. Этот протокол предоставляет мощный инструмент для оценки раковых мутаций и потенциальных терапевтических мишеней для лейкемии.

протокол

Все эксперименты на животных, проводимые в соответствии с этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их благополучию Пекинского университета китайской медицины.

1. Построение плазмид sgRNA, нацеленных на гены-кандидаты (4 - 5 дней)

  1. Спроектируйте целевую sgRNA с помощью онлайн-инструментов проектирования sgRNA. Введите последовательность геномной ДНК мишени в онлайн-инструмент для проектирования sgRNA (например, https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Выберите подходящие мишени sgRNA и упорядочьте необходимые олигонуклеотиды.
  2. Подготовьте олиго-вставки sgRNA. Ресуспендируйте верхнюю и нижнюю нити спроектированных олигон для каждой sgRNA (шаг 1.1) до конечной концентрации 100 μM. Приготовьте смеси в соответствии с таблицей 1 для фосфорилирования и отжига олигонов sgRNA. Используйте следующие параметры термоциклирования: 37 °C в течение 30 мин; 95 °C в течение 5 мин; понизить температуру до 25 °C при 5 °C мин−1.
  3. Добавьте 1 мкл фосфорилированных и отожженных олигонов к 199 мкл ddH2O комнатной температуры для достижения коэффициента разбавления 1:200.
  4. Линеаризуйте векторную плазмиду.
    1. Используя указанный основной вектор (см. Таблицу материалов), расщепите векторную плазмиду с помощью фермента рестрикции Esp3I (BsmBI). Настройте реакции в соответствии с таблицей 1 и инкубируйте при 55 °C в течение 1 ч.
    2. Добавьте 0,5 мкл щелочной фосфатазы креветок (rSAP) в ту же пробирку и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, чтобы снизить вероятность самоконъюгации линейной плазмиды.
    3. Проверьте успешность линеаризации. Загрузите линеаризованные плазмиды и неразрезанные плазмиды для электрофореза в агарозный гель 0,8-1% (по объему).
    4. Очистите линеаризованную плазмиду с помощью набора для очистки ПЦР, внесите 20 мкл ddH2O и количественно определите концентрацию ДНК.
  5. Клонируйте олигопласты sgRNA в векторную плазмиду, настроив реакции лигирования для каждой sgRNA в соответствии с таблицей 1. Выдерживать при 16 °C в течение 4 ч.
  6. Для превращения добавьте 10 мкл продукта с шага 1,5 в 50 мкл ледяных компетентных клеток Stbl3, инкубируйте смесь на льду в течение 30 мин, подвергайте тепловой шок при 42 °C в течение 90 с, а затем немедленно верните ее на лед на 2 мин. Добавьте 200 мкл среды LB, не содержащей антибиотиков, в ту же пробирку, встряхните при 220 об/мин в течение 30 мин при 37 °C, а затем наложите ее на планшет LB, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
  7. На следующий день осмотрите пластины на предмет роста колонии. Из каждой пластины выберите 6-8 колоний и проверьте правильность вставки sgRNA с помощью ПЦР колоний. Выберите положительные колонии и инокулируйте отдельные колонии в 5 мл LB среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, с помощью стерильного наконечника для пипетки. Инкубируйте и встряхните культуру при температуре 37 °C в течение ночи.
  8. Выделите плазмидную ДНК из культур с помощью мини-набора для очистки плазмидной ДНК. Последовательность из промотора U6, чтобы убедиться, что 20-нт направляющая последовательность вставлена правильно.

2. Лентивирусная упаковка (2 - 3 дня)

  1. Культуру клеток HEK 293T в среде DMEM с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (v/v) раствора пенициллин-стрептомицина при 37 °C и 5%CO2.
  2. Проведите HEK293T клетки, отсасывая старую среду из чашки Петри, и аккуратно промойте чашку 2 раза 3 мл PBS. Добавьте 1 мл трипсина в чашку диаметром 10 см и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 1 минуты. Добавьте в чашку 3 мл теплой среды DMEM, чтобы инактивировать трипсин, соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и вращайте при 800 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 5 мл среды и при необходимости переложите клетки в новые чашки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для производства лентивируса используйте клетки HEK 293T с менее чем 10 пассажами.
  3. За 16-24 ч до трансфекции высейте HEK293T клеток в 10-сантиметровые чашки с плотностью 2-4 × 10-6 клеток в чашке. Убедитесь, что используемый DMEM не содержит антибиотиков.
  4. Убедитесь, что в день трансфекции клетки сливаются на 70-80%. Преобразуйте 10-15 г плазмиды на 10 см чашки и поддерживайте молярное соотношение плазмиды на уровне PEI 1:3. Приготовьте Смесь 1 и Смесь 2 для трансфекции в соответствии с Таблицей 2.
  5. Дайте смеси 2 постоять 5 минут. Добавьте смесь 2 в смесь 1 (будьте осторожны, чтобы не изменить порядок добавления), тщательно перемешайте, а затем дайте постоять 15-20 минут.
  6. Добавьте комплекс (шаг 2,5) в ячейки, осторожно встряхните чашку для перемешивания и инкубируйте в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 . Через шесть-8 часов замените среду на среду DMEM (содержащую 10% FBS).
  7. Через два дня после начала лентивирусной трансфекции соберите надосадочную жидкость лентивируса из посуды. Центрифугируйте при 4 000 × г в течение 10 минут при 4 °C и отфильтруйте через микрофильтрационную мембрану 0,45 мкм. Дозируйте лентивирус и храните при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный лентивирус можно концентрировать по мере необходимости. Избегайте снижения титров вируса из-за многократного замораживания и размораживания.

3. Экстракция и культивирование клеток костного мозга (12 - 13 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все линии мышей поддерживались в чистом генетическом фоне C57BL/6. Мыши LSL-Cas9 (T002249) скрещивались с мышами Mx1-Cre13 для получения LSL-Cas9/+; Mx1-Cre/+ мыши. Здесь мы собрали клетки костного мозга из Mx1-Cre/+; Мыши LSL-Cas9/+ и их однопометники.

  1. Чтобы индуцировать экспрессию Cre-рекомбиназы, мышам (в возрасте 8-12 недель) вводили внутрибрюшинно 150 мкл полиинозин-полицитидила (1,5 мг/мл) в 1-й и 3-й день. На 6-й день введите мышам внутрибрюшинно 5-фторурацил (5-FU, 150 мг/кг).
    Примечание: Трансгенные мыши Mx1-Cre сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать Cre-рекомбиназу под контролем индуцируемого промотора Mx113. Внутрибрюшинное введение полиинозин-полицитидила может эффективно активировать промотор Mx1 и индуцировать экспрессию Cre-рекомбиназы14. Инъекция 5-FU используется для истощения пролиферирующих клеток в костном мозге, тем самым вызывая вступление ГСК в клеточный цикл и приводя к относительному обилию ГСК15. Примерно 2-4 ×10-6 клеток костного мозга могут быть собраны на одну мышь после лечения 5-FU.
  2. На 11-й день принесите мышей в жертву с помощью асфиксииСО2 . Возьмите бедренную и большеберцовую кости мышей, промойте полость костного мозга PBS, содержащим 2% FBS, с помощью стерильного шприца объемом 1 мл и соберите клетки костного мозга, как описано в Gavrilescu et al.16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перенесите кости в колпак ламинарного потока, как только большеберцовая и малоберцовая кости будут удалены у мышей, для поддержания стерильности во время сбора клеток костного мозга.
  3. Пипетируйте клетки костного мозга вверх и вниз (в 30-50 раз), чтобы диспергировать их в отдельные клетки, затем переложите клеточную смесь в пробирку объемом 50 мл и хорошо перемешайте вихрем.
  4. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии в 40 мкл буфера для лизиса эритроцитов и поместите его на лед на 5 мин, чтобы эритроциты могли лизироваться. Добавьте 50 μл раствора трипанового синего, хорошо перемешайте и подсчитайте жизнеспособные клетки.
  5. Центрифугируйте клетки при 800 × г в течение 15 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендирование клеток в концентрации 1-2 ×10 6 клеток/мл в среде для предварительной стимуляции костного мозга, как описано в таблице 3. Высейте клетки в посуду по 10 см по 10 мл на тарелку и инкубируйте в течение 24 ч.

4. Лентивирусная трансфекция клеток костного мозга (2 - 3 дня)

  1. На следующий день соберите клетки из предварительно стимулированных пластин. Энергично промойте планшет 5 --10 мл PBS, содержащего 2% FBS. Подсчитайте жизнеспособные клетки, добавив трипановый синий, как описано в шаге 3.4.
  2. Центрифугируйте клетки при 800 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Приготовьте раствор для заражения вирусами, как описано в таблице 4.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в свежеприготовленном растворе для распыления инфекции (∼106 клеток/мл). Засейте взвешенные клетки в 6-луночный планшет по 4 мл на лунку. Запечатайте 6-луночный планшет парапленкой и центрифугируйте планшет при давлении 1 500 × г в течение 90 минут при 32 °C.
  4. После центрифугирования аккуратно суспензируйте клетки с помощью пипетки (но не меняйте среду), затем инкубируйте планшет в течение 4-6 ч в инкубаторе.
  5. Для первой трансфекции осторожно отасуньте как можно больше надосадочной среды из каждой лунки (~3 мл) и добавьте равный объем среды для предварительной стимуляции костного мозга. Если некоторые клетки случайно аспирировались во время процедуры, центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки с небольшим количеством среды для предварительной стимуляции, а затем добавьте их обратно в лунку.
  6. Для вторичной трансфекции на следующий день удалите 2-3 мл среды из каждой лунки и добавьте равный объем свежеразмороженного ретровирусного исходного раствора вместе с соответствующими количествами HEPES и полибрена, как описано в таблице 4. Центрифугируйте планшет при 1 500 × г в течение 90 мин, 37 °C.
  7. После центрифугирования аккуратно ресуспендируйте клетки и продолжайте инкубировать планшет в инкубаторе в течение 4-6 ч.
  8. Замените носитель, как показано в пункте 4.5. Инкубировать в течение 24 ч.

5. Провести in vitro анализ CCK-8 (3 - 4 дня)

  1. Энергично промойте лунки для сбора клеток костного мозга. Промойте пластину PBS, содержащим 2% FBS, чтобы получить максимальное количество ячеек. Отфильтруйте клетки через сито 70 мкм и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего, как описано в шаге 3.4.
  2. Центрифугируйте клетки при 800 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. Ресуспендируйте клетки DMEM, содержащим 10% FBS и mIL-3, mIL-6 (10 нг/мл), mSCF (100 нг/мл) до 1 ×10 5 клеток/мл. Возьмите ~0,5-1 × 106 ячеек и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и храните клеточную гранулу при температуре -80 °C для экстракции геномной ДНК.
  4. Добавьте ячейки в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 ячейки в лунку. Сделайте по шесть лунок для репликации для каждой группы. Добавьте 100 мкл стерильного PBS в круг лунок вокруг лунок, где засеиваются клетки. Инкубировать в течение 0, 24, 48 и 72 часов.
  5. Осторожно отсасывайте среду из 96-луночного планшета в соответствующий момент времени. Добавьте в лунки 110 μл среды, содержащей 1/10 объема CCK-8. Настройте пустую группу (только среда и CCK-8, без ячеек). Инкубировать в инкубаторе в течение 1 ч.
  6. Считывание значения поглощения 450 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра.
  7. Используйте статистическое программное обеспечение для анализа экспериментальных данных и выражайте экспериментальные данные в виде среднего ± стандартного отклонения (среднее ± SD). Проанализируйте различия между двумя группами с помощью t-критерия независимых выборок, при этом P < 0,05 указывает на статистически значимую разницу.

6. Проверка редактирования генов (5 - 7 дней)

  1. Извлеките геномную ДНК (шаг 5.3) с помощью набора для очистки геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Проектные праймеры, которые амплифицируют область от 200 до 500.н., сосредоточенную вокруг сайта разреза sgRNA (табл. 5).
  3. Для секвенирования по Сэнгеру приготовьте смесь, как показано в таблице 6 для ПЦР. Амплифицируйте фрагменты гена-мишени с помощью термоамплификатора следующим образом: 95 °C в течение 5 мин, 40 циклов (95 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 9 с), 72 °C в течение 10 мин, 4 °C ∞.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Редактирование генов также может быть проверено с помощью секвенирования нового поколения (NGS), а продукт ПЦР должен быть очищен с помощью набора для очистки NGS.
  4. Проанализируйте результаты секвенирования по Сэнгеру на веб-сайте TIDE (http://tide.nki.nl). Рассчитайте эффективность редактирования sgRNA, введя последовательность sgRNA и результаты секвенирования как из экспериментальной, так и из контрольной групп в этот онлайн-инструмент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте результаты NGS с помощью CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17. Входные парные чтения (два файла) или односторонние чтения (один файл) в формате fastq или fastq.gz из эксперимента по глубокому секвенированию, вместе с референсной последовательностью и последовательностью sgRNA. Программное обеспечение будет оценивать и количественно оценивать целевой мутагенез.

Результаты

Влияние нокаута Trp53 на пролиферативную способность HSPC мышей
Здесь мы использовали нокаут Trp53 в качестве примера для демонстрации этого протокола. Чтобы исследовать влияние нокаута Trp53 на пролиферативную способность HSPC мыше...

Обсуждение

Технология CRISPR/Cas9 широко используется в биомедицинских исследованиях благодаря своему удобству в использовании и высокой эффективности, облегчая такие приложения, как скрининг функций генов18, моделирование заболеваний19, иммунотерапия

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Пекинский университет китайской медицины за использование общих услуг для завершения этого исследования. Работа выполнена при поддержке Фонда молодых ученых Национального фонда естественных наук Китая (No 31701280 Дж. Чжана).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm microfiltration membraneSartoriu16533K-1
1.5 mL EP tubeLABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm dishCorning430167
15 mL TubeLABLEADLXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)Accurate BiologyAG11010For colony PCR
50 mL TubeLABLEADLXG5000
5-FluorouracilSigmaF6627-1
6-well plateCorning3516
70 µm cell sieveFalcon®352350
96-well platesCorning3599
ACK Lysis BufferLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpicillinSolarbioA8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCRThermofisher
Cell Counting Kit-8BimakeB34304
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5810R
CO2 IncubatorThermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5ZYMOD4014
Dneasy Blood & Tissure KitQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Fetal Bovine SerumExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC;Virginia,USA
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963backbone vector
LSL-Cas9 miceModel Animal
Research Center of
NANJING UNIVERSITY 		T002249
microplate absorbance spectrophotometerBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xSolarbioP1400
pMD2.G plasmidAddgene12259
polybreneBeyotimeC0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium saltSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen28104
RecombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RecombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Regular agaroseBIOWESTBY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro SpectrophotometerMOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cellsBioMedBC108-01 
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201L
T4-LigaseTakara2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid KitTIANGENDP105-03
Trypan Blue solutionLABLEADC0040-100ml
Trypsin-EDTAGibco25200072
TryptoneOXOIDLP0042
WEHI-CMNanjing Fuksai Biotechnology CBP50079
YEAST EXTRACTOXOIDLP0021

Ссылки

  1. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  4. Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml. Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).
  5. Chopra, M., Bohlander, S. K. The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).
  6. Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all. Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).
  7. González-García, S., et al. IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763-763 (2003).
  10. Wang, S. -. W., et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 21 (1), (2022).
  11. Zhao, C., et al. HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control. Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).
  12. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  13. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  14. Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell. 62 (1), 51-61 (1990).
  15. Randall, T. D., Weissman, I. L. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).
  16. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).
  17. Pinello, L., et al. Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso. Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).
  18. Cai, P., et al. A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis. Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).
  19. Ng, S. R., et al. CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).
  20. Crowther, M. D., et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1. Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).
  21. Ma, H., et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).
  22. Szlachta, K., et al. CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response. Nat Commun. 9 (1), 4275 (2018).
  23. Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions. Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).
  24. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).
  25. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219CRISPR Cas9CCK 8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены