从大体积样品中分离来源于间充质干细胞的小细胞外囊泡，符合 GMP 标准，用于临床试验

摘要

来源于间充质干细胞 （MSC-sEVs） 的小细胞外囊泡已被强调为一种无细胞治疗方式，不良反应最小。本研究提供了一种将血液透析与超速离心相结合的方案，显著减少了整个过程所花费的时间，并确保符合药品生产质量管理规范 （GMP） 标准。

摘要

源自间充质干细胞 （MSC-sEV） 的小细胞外囊泡 （sEV） 已被强调是一种无细胞治疗方式，不良反应最小。相比之下，传统的萃取方法（如超速离心和体积排阻色谱）受到其时间强度、成本和可扩展性的限制。为了克服这些限制，我们提出了一种集成血液透析器和超速离心的方法。这种方法利用具有 100 kDa 截留分子量 （MWCO） 膜的血液透析装置，该装置选择性地浓缩 sEV，同时过滤掉大量蛋白质，从而提高 sEV 的产量和纯度。该初始纯化步骤之后进行超速离心，以进一步精制 sEV 制备物。这两项技术的集成不仅显著减少了整个过程所花费的时间，还确保了符合良好生产规范 （GMP） 标准。该方法在从大量样品中分离 sEV 方面表现出很高的效率，与传统方法相比具有重大进步。该方案有望通过提供可扩展、经济高效且符合 GMP 的解决方案，加速基于 EV 的疗法向临床实践的转化。

引言

来源于间充质干细胞 （MSC-sEV） 的细胞外小囊泡是富含多种成分（如 mRNA、micro-RNA、细胞因子、脂质和代谢物）的异质囊泡¹。近年来，许多研究强调了 MSC-sEV 作为一种无细胞治疗方式的巨大治疗潜力，副作用最小²，在解决包括衰老、组织退化、癌症和炎症性疾病在内的一系列疾病方面显示出前景 ^3,4,5,6.然而，大规模提取 sEV 仍然存在一个关键挑战，传统方法被证明要么费力地耗时，要么在经济上不可行。此外，确保可重复性对于基于 EV 的疗法的临床应用和转化至关重要⁷。研究人员迫切需要一种纯化方法，该方法不仅简单高效，而且符合药品生产质量管理规范 （GMP） 标准⁸。

传统的纯化方法，包括超速离心、超滤、体积排阻色谱、免疫亲和和聚合物沉淀，已在以前的研究中得到广泛应用⁹。一般来说，传统的 sEV 分离方法存在局限性，例如产量低、纯度低以及难以满足严格的无菌标准。此外，以前的研究报道了微流体系统^10,11、无标记磁隔离¹² 和共价化学分离¹³ 等有前途的技术在实现出色性能方面的潜力。然而，对专用设备的需求使得大多数研究团队难以采用这些先进技术。总之，从大量样品中分离 GMP 级 sEV 的有效方法仍然是一个关键障碍，限制了众多团队在研究和临床应用方面的进展。

超速离心是 sEV 分离最广泛采用的方法，是公认的金标准方法^14,15。这是一种利用密度和大小的差异来隔离 sEV 的技术。分离的 sEV 通常用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗，以消除残留的污染物。然后，通常使用适当体积的 PBS 重悬冲洗的 sEV，并且可以通过控制 PBS 的体积来收获不同预期浓度的 sEV。此外，据报道，通过超速离心获得的血浆 sEVs 的纯度似乎优于通过体积排阻色谱 （SEC） 分离的血浆 sEVs，并且通过超速离心获得的 sEVs 具有较低的非囊泡细胞外颗粒 （NVEPs） 杂质。这也使得超速离心在许多需要高浓度 sEV 的处理中使用最广泛且难以替代。然而，除了质量和纯度之外，效率也是大体积 sEV 提取中不可忽视的一个因素。到目前为止，单轮超速离心可以支持高达约 600 mL 的样品量，这决定了仅通过超速离心很难满足大规模萃取的需求¹⁶。

血液透析设备由一个基于膜的模块组成，该模块容纳了数千根中空纤维。血液在封闭的圆柱形腔室内通过这些纤维循环¹⁷。血液的成分可以根据其分子大小和离子浓度选择性地穿过这些膜。在临床上，它被广泛用作人工肾，以去除患者血液中的废物和多余液体 18,19,20。换句话说，血液透析器还具有浓缩大体积样品的潜力，依赖于类似于切向流过滤 （TFF） 的工艺。在国际细胞外囊泡学会 （ISEV） 最近发布的指南中，sEV 浓缩物被认为适用于大体积样品，例如细胞培养基。经过几十年的发展，血液透析器已在医院得到广泛采用，并有大量成熟的耗材和一批熟练的作人员提供支持，这使得保持样本无菌变得更加容易。

本研究提出了一种基于与 GMP 兼容的血液透析器和超速离心机的 sEV 纯化方法。在这里，我们选择了 100 kDa 截留分子量 （MWCO） 的透析器，它已被证明可以有效捕获 sEV 并过滤掉许多蛋白质²²。超速离心也为进一步纯化提供了一个步骤。该工作表明，血液透析器同样适用于 sEV 的浓度。该方案允许研究人员有效地从大体积样品中分离 sEV。我们已在中国临床试验注册中心（ChiCTR，NO. ChiCTR2200059018）注册了临床试验，该临床试验仍在进行中，尚未完成。尽管目前尚不容易获得临床数据以供发表，但本协议中报告的可靠、大规模、高效且合规的生产 sEV 的方法是进行临床前和临床试验的先决条件。

研究方案

该方案是根据西南医院人类研究伦理委员会批准和进行的。

1. 从培养基中去除细胞碎片

注：以下程序应在符合 GMP 的环境中作，尤其是当样品可能直接暴露在环境中时。

1. 鉴于无微生物群的要求，请确保过滤器和橡胶管经过高压灭菌以实现有效灭菌。确保可能接触到培养基的所有其他耗材都是无菌的，并且采用密封包装。在层流柜中执行去除细胞碎片的过程。
2. 将 0.45 μm 和 0.22 μm 过滤膜组装到过滤装置上。用橡胶管连接蠕动泵（参见 材料表）和过滤装置。将 0.45 μm 膜置于 0.22 μm 膜上方;否则，它可能会降低过滤效率（图 1）。注意区分微滤膜的正面和背面。
3. 启动蠕动泵进行过滤。在泵的驱动下，含有 5% 补充剂的间充质干细胞基础培养基 （MSCBM）（参见 材料表）从一端通过过滤器，过滤后的培养基可以在过滤器的另一端获得，如图 1 所示。将过滤后的培养基收集在具有双通道的引流袋中。通过优化蠕动泵速度并根据需要更换过滤膜来保持过滤系统的完整性。
4. 过滤完成后，关闭引流袋上的入口阀，并进一步用封口膜密封（参见材料表）。继续下一步或将过滤的细胞培养基暂时储存在 4 °C。

2. 用血液透析器浓缩过滤后的培养基

注意：请勿在细胞培养中使用含有酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），因为血液透析器中的血漏检测器将被激活或关闭血液透析器设置中的血漏检测器。

1. 准备耗材。
   1. 浓缩前准备血管、100 kDa MWCO 高通量聚砜膜、血液透析器、输液器、生理盐水、输液袋、碘溶液和棉签（见 材料表）。
2. 打开系统电源并自检。
   1. 检查血液透析器电源线的连接并打开主电源。
   2. 等待机器完成整个自我诊断过程。
3. 安装 Bloodlines 和透析器。
   1. 验证一次性血液管路和血液透析器的有效期，确保其外包装的完整性并检查血液管路是否有任何损坏。
   2. 沿与体外回路中血流相同的方向安装管道，依次关闭分支阀以形成闭环循环。
4. 开始漂洗程序。
   1. 使用输液装置将生理盐水溶液（不含肝素）从泵前的试管连接到透析回路。将静脉收集部位连接到废液袋。
      注意：生理盐水不应含有肝素或任何其他抗凝剂。
   2. 将透析液供应/回流管路连接到透析器。
   3. 启动血液透析器并将流速设置为 80-100 mL/min。排出透析回路和透析器中的所有空气，以确保整个管道系统充满液体。
   4. 将动脉腔和静脉腔中的液体平面调整至约 2/3 满。生理盐水依次流经动脉管、透析器、静脉管和废液袋。
5. 开始超滤浓缩。
   1. 冲洗程序完成后，将装有过滤培养基的引流袋挂在输液架上，用浸有碘的棉签对输出通道进行消毒，并使用输液器将引流袋的输出通道连接到预泵端口。
   2. 加入血脉的动脉端口和静脉端口。建立隔离的超滤（ISO-UF，无透析液流的超滤）透析回路（图 1）。
   3. 调整透析机上的超滤目标体积，使其与引流袋中的液体总体积相对应。将超滤的透析时间设置为系统的最小运行时间。成功设置参数后，启动超滤。
      注意：由于血液透析系统的计算，透析时间不会太短，但会保持在较适中的速率。
6. 获得浓缩液。
   1. 达到目标脱水量后，关闭动脉夹并将静脉端口连接到无菌输液袋。
   2. 打开装有空气过滤器的一次性血液管路的预泵端口。以大约 50 mL/min 的速度启动血泵，使血管内的液体再次从动脉管路循环到静脉管路。将所有浓缩液体（约 158 mL）从回路中缩回无菌输液袋中。
   3. 在浓缩的后期，从透析液回流管中收集浪费的液体。对废液样品应用与浓缩培养基相同的后续过程，以监测浓缩过程中可能发生的任何 sEV 意外损失。
   4. 关闭所有阀门并取出输液袋、透析器和所有管路。关闭电源并通过擦拭对机器进行消毒。

3. 用超速离心机分离 sEV

1. 将浓缩的培养基转移到超速离心管中，然后平衡它们。
2. 在临床级超速离心机（参见 材料表）中以 110,000 × g 离心 70 分钟，然后用无菌盐水溶液洗涤沉淀，并以 110,000 × g 继续第二次离心 70 分钟。
3. 将沉淀的 sEVs 重悬于适量的无菌盐水溶液中。
4. 将 sEV 转移到无菌管中进行进一步测试，或将其储存在 -80 °C 以备将来使用。

4. 获得的 sEV 的表征

1. 纳米颗粒跟踪分析 （NTA）
   1. 用 PBS （1 mL） 稀释获得的 sEV （1 μL）（参见 材料表）。将当前视野中可见的 sEV 数量调整为 50 到 200 之间。
   2. 小心地将稀释的样品注入样品孔中，避免引入气泡。
   3. 当视野中的粒子数量尽可能高且所有位置都尽可能稳定时执行测量。分析参数如下：最大面积：1000，最小面积：10，最小亮度：30，迹线长度：15，温度：25 °C，灵敏度：75。
   4. 测量每个样品至少 3 次。
2. Western 印迹分析
   1. 在 PBS 中稀释 sEVs 溶液。使用二辛可宁酸 （BCA） 蛋白检测试剂盒（参见 材料表）测量蛋白浓度。
   2. 将 sEVs 在样品缓冲液中于 100 °C 煮沸 5 分钟。
   3. 制备 12% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 凝胶（参见 材料表）。组装凝胶电泳仪。将每个样品的等量蛋白质加载到 SDS-PAGE 凝胶孔中。将电泳电压设置为 80 V 进行浓缩，将 100 V 用于分离。
   4. 用甲醇活化聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜（参见材料表）1 分钟，然后将 PVDF 膜浸泡在转移缓冲液中，然后在 100 V 下继续转移 1 小时。
   5. 将 PVDF 膜浸入含有 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 TBST 缓冲液（20 mM Tris、150 mM NaCl 和 0.1% Tween 20）中，然后封闭 30 分钟。
   6. 将 PVDF 膜与一抗在 4 °C 下在摇床上孵育过夜。使用的一抗如下：人抗 CD63（1：1000 稀释）、人抗 CD9（1：1000 稀释）和人抗 HSP70（1：1000 稀释）（参见 材料表）。
   7. 第二天，用 TBST 溶液洗涤 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟，然后在室温 （RT） 下与 HRP 偶联的二抗（1：10000 稀释）（参见 材料表）孵育 1 小时。
   8. 用 TBST 洗涤 5 次后，使用化学发光检测试剂在化学发光系统上成像。
3. 透射电子显微镜
   1. 将 20 μL PBS 稀释的样品滴加入蜡纸中。然后，将铜网格（参见 材料表）放在液滴上，使样品滴可以覆盖铜网格，并使其在 RT 下静置 20 分钟。
   2. 用滤纸吸收多余的液体。然后，将样品固定在 20 μL 多聚甲醛、2% 戊二醛和 0.05 M 磷酸盐溶液中 2 分钟。
   3. 用双蒸水冲洗铜网格 3 次，然后在室温下用 20 μL 2% 磷钨酸 （PTA） 染色 1 分钟。
   4. 用滤纸吸收多余的液体。在通过透射电子显微镜分析之前，将网格干燥过夜（参见 材料表）。
      注意：TEM 的推荐设置如下：曝光：1.0 s，HT 电压 100.00 kV，束流：50 μA，光斑大小：1，模式：TEM。这些设置可能会按照制造商的说明进行更改（请参阅 材质表）。

结果

sEVs 的形态学表征
在浓缩的最后阶段，也如前所述收集废液。浓缩培养基和废液分别超速离心。我们收集了沉淀物用于透射电子显微镜 （TEM） 分析。正如预期的那样，在浓缩培养基组中观察到大量杯状纳米囊泡（图 2A、B）。然而，在废液组中未检测到典型的 sEV 颗粒。这些发现提供了证据，表明...

讨论

分离 sEV 的传统方法包括差速超速离心、体积排阻色谱和 PEG 沉淀，每种方法各有优缺点。虽然这些不同技术的融合可能会提高 sEV 的产量或纯度，但额外的步骤通常会带来更多样品污染的机会。市场上出现了声称可以批量提取 sEV 并符合 GMP 标准的集成系统²¹.然而，它们的广泛采用带来了重大的经济挑战，尤其是对于越来越多的电动汽车研究团队而言。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD63	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:1000 dilution
Anti-CD9	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:1000 dilution
Anti-HSP70	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit	Beyotime	P0012
Bloodlines	Fresenius Medical Care	AP16641
Bovine serum albumin 5%	Solarbio	9048-46-8
Cell culture supplement	Helios	HPCPLCGL05	5% (v/v) in cell culture media
Copper grid	Precise	RGRS GP-SMPG-1
Dialyzer	Helixone	FX8	100 kDa MWCO
Drainage bag	CZRUIDE	YLD-01
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)	Dakewe	DKW34-BM20500
Microfiltration membrane	shanghaixingya	WKLM-50-10	0.45 μm and 0.22 μm
Parafilm	Fisher Scientific	1337416
Peristaltic pump	LongerPump	YZ1515x
Phosphate buffer saline	Solarbio	P1022-500ml
Immun-Blot PVDF Membrane	BIO-RAD	1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0015A
Super ECL Plus Western Blotting Substrate	BIOGROUND	BG0001
TBST buffer	Solarbio	T1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman	344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	BIO-RAD
Hemodialyzer	NIKKISO	DBB-27
Nanoparticle Tracking Analysis	ZetaView	PMX120	To measure particle size distribution and particle concentration
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM-1400PLUS	Recommended settings：Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	OPTIMA XPN-100	SW 28Ti SwingingBucket Rotor