JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم التأكيد على الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثار الضارة. توفر هذه الدراسة بروتوكولا يجمع بين غسيل الكلى والطرد المركزي الفائق ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت المستغرق في العملية برمتها ويضمن الامتثال لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP).

Abstract

تم التأكيد على الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثار الضارة. في المقابل ، فإن طرق الاستخراج التقليدية مثل الطرد المركزي الفائق والكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم محدودة بكثافة الوقت والتكلفة وقابلية التوسع. للتغلب على هذه القيود ، نقترح طريقة تدمج جهاز تحليل الكلى والطرد المركزي الفائق. يستخدم هذا النهج جهاز غسيل الكلى بغشاء قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) ، والذي يركز بشكل انتقائي على المركبات الكهربائية الكهربائية أثناء تصفية عدد كبير من البروتينات ، وبالتالي تعزيز إنتاجية ونقاء المركبات الكهربائية الكهربائية. يتبع خطوة التنقية الأولية هذه الطرد المركزي الفائق لتحسين إعداد sEV بشكل أكبر. لم يقتصر دمج هاتين التقنيتين على تقليل الوقت المستغرق في العملية برمتها بشكل كبير فحسب ، بل ضمن أيضا الامتثال لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP). توضح الطريقة هنا كفاءة عالية في عزل المركبات الكهربائية الكهربائية عن حجم كبير من العينات ، مما يوفر تقدما كبيرا على الطرق التقليدية. يبشر هذا البروتوكول بتسريع ترجمة العلاجات القائمة على المركبات الكهربائية إلى ممارسة سريرية من خلال توفير حل قابل للتطوير وفعال من حيث التكلفة ومتوافق مع GMP.

Introduction

الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC-sEVs) هي حويصلات غير متجانسة غنية بمكونات متعددة مثل mRNA و micro-RNA والسيتوكينات والدهون والمستقلبات1. في السنوات الأخيرة ، أكدت العديد من الدراسات الإمكانات العلاجية الهائلة ل MSC-sEVs كطريقة علاج خالية من الخلايا مع الحد الأدنى من الآثارالضارة 2 ، مما يبشر بالخير في معالجة مجموعة من الحالات ، بما في ذلك الشيخوخة وتنكس الأنسجة والسرطان والاضطراب الالتهابي3،4،5،6. ومع ذلك ، لا يزال هناك تحد خطير في استخراج المركبات الكهربائية على نطاق واسع ، حيث أثبتت الطرق التقليدية أنها إما تستغرق وقتا طويلا أو غير مجدية اقتصاديا. علاوة على ذلك ، يعد ضمان قابلية التكاثر أمرا بالغ الأهمية للتطبيق السريري وترجمة العلاجات القائمة على EV7. الباحثون في حاجة ماسة إلى طريقة تنقية ليست بسيطة وفعالة فحسب ، بل تتوافق أيضا مع معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP)8.

تم تطبيق طرق التنقية التقليدية ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق ، والترشيح الفائق ، والكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم ، والتقارب المناعي ، وهطول الأمطار البوليمرية ، على نطاق واسع في الأبحاث السابقة9. بشكل عام ، تظهر الطرق التقليدية لعزل sEV قيودا مثل معدل الإنتاجية المنخفض ، والنقاء المخترق ، والتحديات في تلبية المعايير المعقمة الصارمة. علاوة على ذلك ، أفادت الأبحاث السابقة بإمكانيات التقنيات الواعدة مثل أنظمة الموائع الدقيقة10،11 ، والعزل المغناطيسي الخالي من الملصقات12 ، وعزل الكيمياء التساهمية13 لتحقيق أداء متميز. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى المعدات المتخصصة تجعل هذه التقنيات المتقدمة صعبة بالنسبة لغالبية فرق البحث لاعتمادها. باختصار ، لا تزال الطريقة الفعالة لعزل المركبات الكهربائية من فئة GMP من حجم كبير من العينات عقبة خطيرة ، مما يحد من تقدم العديد من الفرق في كل من التطبيقات البحثية والسريرية.

الطرد المركزي الفائق هو الطريقة الأكثر اعتمادا على نطاق واسع لعزل sEV ومعترف به على أنه الطريقة القياسية الذهبية14،15. إنها تقنية تستفيد من الاختلافات في الكثافة والحجم لعزل المركبات الكهربائية الكهربائية. عادة ما يتم شطف المركبات الكهربائية المعزولة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للتخلص من الملوثات المتبقية. بعد ذلك ، يتم استخدام حجم مناسب من PBS بشكل عام لإعادة تعليق sEVs المغسولة ويمكن حصاد تركيزات متوقعة مختلفة من sEVs عن طريق التحكم في حجم PBS. علاوة على ذلك ، يذكر أن نقاء sEVs البلازما التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق يبدو أفضل من نقاء sEVs البلازما المعزولة بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وأن sEVs التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق لها شوائب أقل من الجسيمات غير الحويصلية خارج الخلية (NVEPs). هذا يجعل الطرد المركزي الفائق هو الأكثر استخداما ويصعب استبداله في العديد من العلاجات التي تتطلب تركيزات عالية من مركبات الكهربائية. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الجودة والنقاء ، فإن الكفاءة هي أيضا عامل لا يمكن تجاهله في استخراج sEV بكميات كبيرة. حتى الآن ، يمكن لجولة واحدة من أجهزة الطرد المركزي الفائقة أن تدعم حجم عينة يصل إلى حوالي 600 مل ، مما يحدد أنه من الصعب تلبية الطلب على الاستخراج على نطاق واسع عن طريق الطرد المركزيالفائق 16 فقط.

يتكون جهاز غسيل الكلى من وحدة غشائية تحتوي على آلاف الألياف المجوفة. يدور الدم من خلال هذه الألياف داخل غرفة أسطوانية مغلقة17. يمكن أن تمر مكونات الدم بشكل انتقائي عبر هذه الأغشية بناء على حجمها الجزيئي وتركيزها الأيوني. في العيادة ، يستخدم على نطاق واسع ككلية اصطناعية لإزالة الفضلات والسوائل الزائدة من دم المرضى18،19،20. بمعنى آخر ، فإن جهاز غسيل الكلى لديه أيضا القدرة على تركيز عينات كبيرة الحجم ، بالاعتماد على عملية مشابهة لترشيح التدفق العرضي (TFF). في الإرشادات الأخيرة الصادرة عن الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV) ، تعتبر مركزات sEV مناسبة للعينات كبيرة الحجم ، مثل وسط زراعة الخلايا. بعد عقود من التطوير ، تم اعتماد أجهزة تحليل الكلى على نطاق واسع في المستشفيات ، مدعومة بوفرة من المواد الاستهلاكية الناضجة ومجموعة من المشغلين المهرة ، مما يسهل الحفاظ على العينة معقمة.

تقدم هذه الدراسة طريقة تنقية sEV تعتمد على جهاز تحليل الكلى وجهاز الطرد المركزي الفائق المتوافق مع GMPs. هنا ، نختار أجهزة غسيل الكلى بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) ، والتي ثبت أنها تلتقط بشكل فعال sEVs وتصفية العديد منالبروتينات 22. يوفر الطرد المركزي الفائق أيضا خطوة لمزيد من التنقية. يوضح العمل أن جهاز غسيل الكلى مناسب بنفس القدر لتركيز sevs. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بعزل المركبات الكهربائية الصغيرة عن العينات كبيرة الحجم بكفاءة. لقد سجلنا التجربة السريرية في سجل التجارب السريرية الصيني (ChiCTR ، رقم ChiCTR2200059018) ، والتي لا تزال قيد التقدم ولم تكتمل بعد. على الرغم من أن البيانات السريرية غير متاحة بسهولة للنشر في هذه اللحظة ، إلا أن طريقة موثوقة وواسعة النطاق وفعالة ومتوافقة لإنتاج مركبات المركبات الكهربائية كما هو مذكور في هذا البروتوكول هي شرط أساسي لإجراء التجارب قبل السريرية والسريرية.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول وتنفيذه وفقا للجنة أخلاقيات البحث البشري في مستشفى ساوث ويست.

1. إزالة بقايا الخلية من وسط الاستزراع

ملاحظة: يجب تشغيل الإجراءات أدناه في بيئة متوافقة مع GMP، خاصة عندما تتعرض العينات مباشرة للبيئة.

  1. نظرا لمتطلبات خالية من الجراثيم ، تأكد من تعقيم الفلتر والأنبوب المطاطي للتعقيم الفعال. تأكد من أن جميع المواد الاستهلاكية الأخرى التي قد تواجه وسط الاستزراع معقمة وفي عبوات محكمة الغلق. قم بإجراء عملية إزالة بقايا الخلية في خزانة التدفق الصفيحي.
  2. قم بتجميع غشاء الترشيح 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر في جهاز المرشح. قم بتوصيل مضخة تمعجية (انظر جدول المواد) وجهاز المرشح بالأنبوب المطاطي. ضع الغشاء 0.45 ميكرومتر فوق الغشاء 0.22 ميكرومتر ؛ خلاف ذلك ، قد يقلل من كفاءة الترشيح (الشكل 1). انتبه للتمييز بين الجانبين الأمامي والخلفي لغشاء الترشيح الدقيق.
  3. ابدأ المضخة التمعجية للترشيح. بالطاقة بواسطة المضخة ، يمر الوسط القاعدي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCBM) مع مكمل 5٪ (انظر جدول المواد) عبر المرشح من أحد طرفيه ، ويمكن الحصول على وسط الثقافة المصفى في الطرف الآخر من المرشح ، كما هو موضح في (الشكل 1). اجمع وسط الاستزراع المفلتر في كيس تصريف بقنوات مزدوجة. الحفاظ على سلامة نظام الترشيح من خلال تحسين سرعة المضخة التمعجية واستبدال غشاء الترشيح حسب الحاجة.
  4. بعد اكتمال الترشيح ، أغلق صمام المدخل الموجود على كيس الصرف وأغلقه باستخدام البارافيلم (انظر جدول المواد). تابع إلى الخطوة التالية أو قم بتخزين وسط زراعة الخلايا المفلترة مؤقتا عند 4 درجات مئوية.

2. تركيز وسط الثقافة المفلترة باستخدام جهاز غسيل الكلى

ملاحظة: الامتناع عن استخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الذي يحتوي على الفينول الأحمر في مزرعة الخلايا ، حيث سيتم تنشيط كاشف تسرب الدم في جهاز غسيل الكلى أو إيقاف تشغيل كاشف تسرب الدم في إعداد جهاز غسيل الكلمة.

  1. تحضير المواد الاستهلاكية.
    1. تحضير السلالات ، 100 كيلو دالتون MWCO أغشية البولي سلفون عالية التدفق ، جهاز غسيل الدم ، مجموعة التسريب ، محلول ملحي فسيولوجي ، كيس التسريب ، محلول اليود ، ومسحات القطن قبل التركيز (انظر جدول المواد).
  2. قم بتشغيل النظام والاختبار الذاتي.
    1. تحقق من توصيل كابل طاقة جهاز تحليل الكلى وقم بتشغيل الطاقة الرئيسية.
    2. انتظر حتى يكمل الجهاز إجراء التشخيص الذاتي بالكامل.
  3. قم بتثبيت السلالات وجهاز غسيل الكلى.
    1. تحقق من تواريخ انتهاء صلاحية السلالات التي تستخدم لمرة واحدة وجهاز غسيل الكلى ، وتأكد من سلامة عبواتها الخارجية والتحقق من عدم وجود أي تلف في الخطوط.
    2. قم بتثبيت الأنبوب في نفس اتجاه تدفق الدم في الدائرة خارج الجسم ، وإغلاق الصمامات الفرعية بالتتابع لتشكيل دورة دوران مغلقة الحلقة.
  4. ابدأ عملية الشطف.
    1. استخدم مجموعة التسريب لتوصيل المحلول الملحي الفسيولوجي (بدون الهيبارين) من أنبوب قبل المضخة بدائرة غسيل الكلى. قم بتوصيل موقع التجميع الوريدي بكيس سائل النفايات.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي المحلول الملحي الفسيولوجي على الهيبارين أو أي مضادات تخثر أخرى.
    2. قم بتوصيل خطوط إمداد / إرجاع غسيل الكلى بجهاز غسيل الكلى.
    3. ابدأ تشغيل جهاز غسيل الكلى واضبط معدل التدفق على 80-100 مل / دقيقة. طرد كل الهواء من دائرة غسيل الكلى وجهاز غسيل الكلى لضمان امتلاء نظام الأنابيب بالكامل بالسوائل.
    4. اضبط مستوى السائل في الغرف الشريانية والوريدية إلى 2/3 ممتلئ تقريبا. يتدفق المحلول الملحي بالتتابع عبر الخط الشرياني وجهاز غسيل الكلى والخط الوريدي وكيس سائل النفايات.
  5. ابدأ تركيز الترشيح الفائق.
    1. بعد الانتهاء من إجراء الشطف ، قم بتعليق كيس التصريف الذي يحتوي على وسط الثقافة المصفى على حامل التسريب ، وقم بتطهير قناة الإخراج بمسحات قطنية مبللة باليود ، وقم بتوصيل قناة الإخراج لكيس الصرف بمنفذ ما قبل المضخة باستخدام مجموعة التسريب.
    2. انضم إلى المنفذ الشرياني والمنفذ الوريدي للسلالات. إنشاء دائرة غسيل الكلى المعزولة (ISO-UF ، الترشيح الفائق بدون تدفق غسيل الكلى) (الشكل 1).
    3. اضبط الحجم المستهدف للترشيح الفائق على جهاز غسيل الكلى ليتوافق مع الحجم الكلي للسائل الموجود في كيس التصريف. اضبط وقت غسيل الكلى للترشيح الفائق على الحد الأدنى لوقت تشغيل النظام. بعد تعيين المعلمات بنجاح ، ابدأ الترشيح الفائق.
      ملاحظة: نظرا لحساب نظام غسيل الكلى ، لن يكون وقت غسيل الكلى قصيرا جدا ولكن سيتم الحفاظ عليه بمعدل أكثر اعتدالا.
  6. احصل على السائل المركز.
    1. بعد تحقيق حجم الجفاف المستهدف ، أغلق المشبك الشرياني وقم بتوصيل المنفذ الوريدي بكيس تسريب معقم.
    2. افتح منفذ ما قبل الضخ لخطوط الدم التي تستخدم لمرة واحدة والمجهزة بفلتر هواء. قم بتنشيط مضخة الدم بسرعة 50 مل / دقيقة تقريبا ، مما يسمح للسائل داخل السلالات بالدوران مرة أخرى من الخط الشرياني إلى الخط الوريدي. اسحب كل السائل المركز ، حوالي 158 مل ، من الدائرة مرة أخرى إلى كيس التسريب المعقم.
    3. في المرحلة المتأخرة من التركيز ، اجمع السائل الضائع من خط عودة غسيل الكلى. قم بتطبيق العمليات اللاحقة المماثلة لتلك الخاصة بوسط الاستزراع المركز على عينة السوائل المهدرة لمراقبة أي خسارة عرضية للمركبات الكهربائية الكهربائية.
    4. أغلق جميع الصمامات وقم بإزالة كيس التسريب وجهاز غسيل الكلى وجميع الخطوط. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وتطهير الجهاز عن طريق مسحه.

3. فصل sEVs مع أجهزة الطرد المركزي الفائقة

  1. انقل وسط الاستزراع المركز إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق ثم قم بموازنتها.
  2. جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي فائق من الدرجة السريرية (انظر جدول المواد) عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة ، ثم اغسل الحبيبات بمحلول ملحي معقم واستمر في الطرد المركزي الثاني عند 110,000 × جم لمدة 70 دقيقة أخرى.
  3. أعد تعليق مركبات الكهربائي المحببة في كمية مناسبة من محلول ملحي معقم.
  4. انقل مركبات المركبات الكهربائية إلى أنبوب معقم لمزيد من الاختبارات أو قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. توصيف المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    1. قم بتخفيف sEVs التي تم الحصول عليها (1 ميكرولتر) باستخدام PBS (1 مل) (انظر جدول المواد). اضبط عدد مركبات المركبات الكهربائية المرئية في مجال الرؤية الحالي ليكون بين 50 و 200.
    2. قم بحقن العينة المخففة بعناية في العينة جيدا ، وتجنب إدخال فقاعات الهواء.
    3. قم بإجراء القياس عندما يكون عدد الجسيمات في مجال الرؤية مرتفعا ومستقرا قدر الإمكان لجميع المواضع. معلمات التحليل هي كما يلي: الحد الأقصى للمساحة: 1000 ، الحد الأدنى للمساحة: 10 ، الحد الأدنى للسطوع: 30 ، طول التتبع: 15 ، درجة الحرارة: 25 درجة مئوية ، الحساسية: 75.
    4. قم بقياس كل عينة ثلاث مرات على الأقل.
  2. تحليل النشاف الغربي
    1. تخفيف حل sEVs في PBS. استخدم مجموعة فحص البروتين بحمض البيسنشونيك (BCA) (انظر جدول المواد) لقياس تركيز البروتين.
    2. قم بغلي المركبات الكهربائية الكهربائية في المخزن المؤقت للعينة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإعداد جل الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم بنسبة 12٪ (SDS-PAGE) (انظر جدول المواد). قم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي للهلام. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين من كل عينة في آبار جل SDS-PAGE. اضبط جهد الرحلان الكهربائي على 80 فولت للتركيز و 100 فولت للفصل.
    4. قم بتنشيط غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (انظر جدول المواد) بالميثانول لمدة 1 دقيقة ، ثم انقع غشاء PVDF في مخزن مؤقت للنقل قبل متابعة النقل عند 100 فولت لمدة 1 ساعة.
    5. اغمر غشاء PVDF في عازلة TBST (20 ملي مولار تريس ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ توين 20) التي تحتوي على 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA ؛ انظر جدول المواد) ثم قم بتثبيتها لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان غشاء PVDF بالجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي كما يلي: الأجسام المضادة البشرية ل CD63 (تخفيف 1: 1000) ، ومضاد CD9 البشري (تخفيف 1: 1000) ، ومضاد HSP70 البشري (تخفيف 1: 1000) (انظر جدول المواد).
    7. في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF بمحلول TBST خمس مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ثم احتضانه بجسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP (تخفيف 1: 10000) (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    8. بعد الغسيل باستخدام TBST خمس مرات ، استخدم كاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي للتصوير على نظام التلألؤ الكيميائي.
  3. الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال
    1. أضف قطرة عينة مخففة بسعة 20 ميكرولتر من PBS إلى ورق شمع. بعد ذلك ، ضع شبكة نحاسية (انظر جدول المواد) على القطرة حتى تتمكن قطرة العينة من تغطية الشبكة النحاسية واتركها تقف عند RT لمدة 20 دقيقة.
    2. امتصاص السوائل الزائدة بورق الترشيح. بعد ذلك ، قم بإصلاح العينات في محلول 20 ميكرولتر من محلول 2٪ بارافورمالدهيد ، و 2٪ جلوتارالديهايد ، و 0.05 M محلول فوسفات لمدة دقيقتين.
    3. اشطف الشبكة النحاسية ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج ، ثم قم بتلطيخ 20 ميكرولتر من حمض الفوسفوتونغستيك 2٪ (PTA) لمدة 1 دقيقة في RT.
    4. امتصاص السائل الزائد باستخدام ورق الترشيح. جفف الشبكات طوال الليل قبل تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: الإعدادات الموصى بها ل TEM هي كما يلي: التعريض الضوئي: 1.0 ثانية ، جهد HT 100.00 كيلو فولت ، تيار الحزم: 50 μA ، حجم البقعة: 1 ، الوضع: TEM. قد تتغير هذه الإعدادات باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

النتائج

التوصيف المورفولوجي للمركبات الكهربائية الكهربائية.
في المرحلة الأخيرة من التركيز ، تم أيضا جمع السائل المهدر كما هو موصوف. تم طرد الوسط المركز والسائل المهدر على التوالي. قمنا بجمع الترسبات لتحليل المجهر الإلكتروني (TEM). كما هو متوقع ، لوحظ ?...

Discussion

تشمل الطرق التقليدية لعزل المركبات الكهربائية التفاضلية ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهطول الأمطار PEG ، ولكل منها مزاياها وعيوبها. في حين أن دمج هذه التقنيات المتباينة قد يعزز إنتاجية أو نقاء المركبات الكهربائية ، فإن الخطوات الإضافية غالبا ما توفر المزيد من الفرص ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (822101167 ، إلى BB) ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (CSTB2022NSCQ-MSX0020 إلى BB) ، ودكتوراه في تشونغتشينغ "من خلال القطار" مشروع البحث العلمي في الصين (CSTB2022BSXM-JCX0031 إلى BB) والمؤسسة الوطنية للعلوم الصينية (82271132 إلى YL). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها قسم أمراض الكلى ، والمستشفى التابع الأول ، والجامعة الطبية العسكرية الثالثة (الجامعة الطبية العسكرية) ، ومعهد علم الأمراض ومركز السرطان الجنوبي الغربي ، ومستشفى ساوث ويست ، والجامعة الطبية العسكرية الثالثة (الجامعة الطبية العسكرية) للمعدات والدعم الفني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 dilution
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 dilution
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay KitBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CareAP16641
Bovine serum albumin 5%Solarbio9048-46-8
Cell culture supplementHeliosHPCPLCGL055% (v/v) in cell culture media
Copper gridPreciseRGRS GP-SMPG-1
DialyzerHelixoneFX8100 kDa MWCO
Drainage bagCZRUIDEYLD-01
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Microfiltration membraneshanghaixingyaWKLM-50-100.45 μm and 0.22 μm 
ParafilmFisher Scientific1337416
Peristaltic pumpLongerPumpYZ1515x
Phosphate buffer salineSolarbioP1022-500ml
Immun-Blot PVDF MembraneBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
TBST bufferSolarbioT1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mLBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Nanoparticle Tracking AnalysisZetaViewPMX120To measure particle size
distribution and particle
concentration
Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM-1400PLUSRecommended settings?Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti SwingingBucket Rotor

References

  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17 (2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199 (2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605 (2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179 (2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480 (2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522 (2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971 (2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604 (2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871 (2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907 (2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237 (2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296 (2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128 (2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932 (2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892 (2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186 (2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved