Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales a partir de muestras de gran volumen con cumplimiento de GMP para ensayos clínicos

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) han sido subrayadas como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos. Este estudio proporciona un protocolo que combina la hemodiálisis con la ultracentrifugación, reduciendo significativamente el tiempo empleado en todo el proceso y asegurando el cumplimiento de las normas de buenas prácticas de fabricación (GMP).

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) han sido subrayadas como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos. Por el contrario, los métodos de extracción tradicionales, como la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión por tamaño, están limitados por su intensidad de tiempo, costo y escalabilidad. Para superar estas limitaciones, proponemos un método que integra un hemodializador y ultracentrifugación. Este enfoque utiliza un dispositivo de hemodiálisis con una membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que concentra selectivamente los sEV mientras filtra una gran cantidad de proteínas, mejorando así el rendimiento y la pureza de los sEV. A este paso inicial de purificación le sigue la ultracentrifugación para refinar aún más la preparación del sEV. La integración de estas dos tecnologías no solo redujo significativamente el tiempo dedicado a todo el proceso, sino que también garantizó el cumplimiento de las normas de buenas prácticas de fabricación (GMP). El método aquí demuestra una alta eficiencia en el aislamiento de sEV de un gran volumen de muestras, lo que ofrece un avance significativo sobre los métodos tradicionales. Este protocolo es prometedor para acelerar la traslación de las terapias basadas en VE a la práctica clínica al proporcionar una solución escalable, rentable y que cumple con las GMP.

Introducción

Las pequeñas vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales (MSC-sEVs) son vesículas heterogéneas enriquecidas con múltiples componentes como ARNm, micro-ARN, citocinas, lípidos y metabolitos¹. En los últimos años, muchos estudios han subrayado el inmenso potencial terapéutico de los MSC-sEV como una modalidad de tratamiento libre de células con efectos adversos mínimos², mostrándose prometedores para abordar un espectro de afecciones, incluido el envejecimiento, la degeneración de tejidos, el cáncer y el trastorno inflamatorio ^3,4,5,6. Sin embargo, persiste un desafío crítico en la extracción a gran escala de sEV, ya que los métodos tradicionales demuestran ser laboriosamente lentos o económicamente inviables. Además, garantizar la reproducibilidad es primordial para la aplicación clínica y la traslación de las terapias basadas en VE⁷. Los investigadores necesitan urgentemente un método de purificación que no solo sea simple y eficiente, sino que también cumpla con los estándares de buenas prácticas de fabricación (GMP)⁸.

Los métodos convencionales de purificación, incluyendo la ultracentrifugación, la ultrafiltración, la cromatografía de exclusión por tamaño, la inmunoafinidad y la precipitación de polímeros, se han aplicado ampliamente en investigaciones^{previas 9}. En general, los métodos tradicionales para el aislamiento de sEV presentan limitaciones como una baja tasa de rendimiento, una pureza comprometida y desafíos para cumplir con los estrictos estándares asépticos. Además, investigaciones anteriores han informado del potencial de técnicas prometedoras como los sistemas microfluídicos^10,11, el aislamiento magnético sin etiquetas¹² y el aislamiento químico covalente¹³ para lograr un rendimiento excepcional. Sin embargo, la necesidad de equipos especializados hace que la adopción de estas técnicas avanzadas sea un reto para la mayoría de los equipos de investigación. En resumen, el método eficiente para aislar sEV de grado GMP de un gran volumen de muestras sigue siendo un obstáculo crítico, lo que limita el progreso de numerosos equipos tanto en investigación como en aplicaciones clínicas.

La ultracentrifugación es el método más ampliamente adoptado para el aislamiento de sEV y es reconocido como el método de referencia^14,15. Es una técnica que aprovecha las diferencias de densidad y tamaño para aislar los sEV. Los SEV aislados se enjuagan comúnmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los contaminantes residuales. A continuación, se suele utilizar un volumen adecuado de PBS para resuspender los sEV enjuagados y se pueden cosechar diferentes concentraciones esperadas de sEV controlando el volumen de PBS. Además, se ha informado de que la pureza de los sEV de plasma obtenidos por ultracentrifugación parece ser mejor que la de los sEV de plasma aislados por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), y los sEV obtenidos por ultracentrifugación tienen menos impurezas de partículas extracelulares no vesiculares (NVEP). Esto también hace que la ultracentrifugación sea la más utilizada y difícil de reemplazar en muchos tratamientos que requieren altas concentraciones de sEV. Sin embargo, además de la calidad y la pureza, la eficiencia también es un factor que no se puede ignorar en la extracción de sEV de gran volumen. Hasta ahora, una sola ronda de ultracentrifugación puede soportar un volumen de muestra de hasta aproximadamente 600 mL, lo que determina que es difícil satisfacer la demanda de extracción a gran escala solo por ultracentrifugación¹⁶.

Un dispositivo de hemodiálisis consiste en un módulo basado en una membrana que alberga miles de fibras huecas. La sangre circula a través de estas fibras dentro de una cámara cilíndrica cerrada¹⁷. Los constituyentes de la sangre pueden pasar selectivamente a través de estas membranas en función de su tamaño molecular y concentración iónica. En la clínica, es ampliamente utilizado como riñón artificial para eliminar los productos de desecho y el exceso de líquidos de la sangre de los pacientes 18,19,20. En otras palabras, el hemodializador también tiene el potencial de concentrar muestras de gran volumen, basándose en un proceso similar a la filtración de flujo tangencial (TFF). En la reciente directriz emitida por la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), los concentrados de sEV se consideran adecuados para muestras de gran volumen, como el medio de cultivo celular. Después de décadas de desarrollo, los hemodializadores han sido ampliamente adoptados en los hospitales, respaldados por una gran cantidad de consumibles maduros y un grupo de operadores calificados, lo que facilita mantener la muestra estéril.

En este estudio se presenta un método de purificación de sEV basado en un hemodializador y una ultracentrífuga compatibles con GMPs. En este caso, elegimos dializadores de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que se ha demostrado que capturan eficazmente las sEV y filtran numerosas proteínas²². La ultracentrifugación también proporciona un paso para una mayor purificación. El trabajo demuestra que el hemodializador es igualmente adecuado para la concentración de sEVs. Este protocolo permite a los investigadores aislar sEV de muestras de gran volumen de manera eficiente. Hemos registrado el ensayo clínico en el Registro Chino de Ensayos Clínicos (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), que aún está en curso y aún no se ha completado. Aunque los datos clínicos no están disponibles para su publicación en este momento, un método confiable, a gran escala, eficiente y compatible para producir sEV como se informa en este protocolo es un requisito previo para realizar ensayos preclínicos y clínicos.

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Protocolo

El protocolo fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con el Comité de Ética de Investigación en Humanos del Southwest Hospital.

1. Eliminación de los restos celulares del medio de cultivo

NOTA: Los procedimientos a continuación deben operarse en un entorno que cumpla con las GMP, especialmente cuando las muestras pueden exponerse directamente al medio ambiente.

1. Dado el requisito de estar libre de microbiota, asegúrese de que el filtro y el tubo de goma se esterilizen en autoclave para una esterilización eficaz. Asegúrese de que todos los demás consumibles que puedan entrar en contacto con el medio de cultivo estén estériles y en envases sellados. Realice el proceso de eliminación de residuos celulares en una cabina de flujo laminar.
2. Ensamble la membrana de filtración de 0,45 μm y 0,22 μm en el aparato de filtro. Conecte una bomba peristáltica (ver Tabla de Materiales) y el aparato de filtro con el tubo de goma. Coloque la membrana de 0,45 μm por encima de la membrana de 0,22 μm; de lo contrario, puede disminuir la eficiencia de filtración (Figura 1). Preste atención a distinguir entre los lados delantero y trasero de la membrana de microfiltración.
3. Ponga en marcha la bomba peristáltica para la filtración. Alimentado por la bomba, el medio basal de células madre mesenquimales (MSCBM) con un suplemento del 5% (ver Tabla de Materiales) pasa a través del filtro desde un extremo, y el medio de cultivo filtrado se puede obtener en el otro extremo del filtro, como se muestra en (Figura 1). Reúna el medio de cultivo filtrado en una bolsa de drenaje con canales dobles. Mantenga la integridad del sistema de filtración optimizando la velocidad de la bomba peristáltica y reemplazando la membrana de filtración según sea necesario.
4. Una vez completada la filtración, cierre la válvula de entrada de la bolsa de drenaje y séllela aún más con parafilm (consulte la tabla de materiales). Continúe con el siguiente paso o almacene temporalmente el medio de cultivo celular filtrado a 4 °C.

2. Concentración del medio de cultivo filtrado con un hemodializador

NOTA: Absténgase de usar el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene rojo de fenol en cultivo celular, ya que el detector de fugas de sangre en el hemodializador se activará o apagará el detector de fugas de sangre en la configuración del hemodializador.

1. Prepara los consumibles.
   1. Prepare líneas de sangre, membranas de polisulfona de alto flujo MWCO de 100 kDa, dializador de sangre, equipo de infusión, solución salina fisiológica, bolsa de infusión, solución de yodo e hisopos de algodón antes de la concentración (consulte la tabla de materiales).
2. Encienda el sistema y realice la autoevaluación.
   1. Compruebe la conexión del cable de alimentación del hemodializador y encienda la alimentación principal.
   2. Espere a que la máquina complete todo el procedimiento de autodiagnóstico.
3. Instale las líneas de sangre y el dializador.
   1. Verifique las fechas de caducidad de las líneas de sangre desechables y del dializador de sangre, garantizando la integridad de su embalaje exterior y comprobando si hay daños en las líneas.
   2. Instale el tubo en la misma dirección que el flujo sanguíneo en el circuito extracorpóreo, cerrando secuencialmente las válvulas de derivación para formar una circulación de circuito cerrado.
4. Inicie el procedimiento de enjuague.
   1. Utilice un equipo de infusión para conectar la solución salina fisiológica (sin heparina) desde un tubo antes de la bomba hasta el circuito de diálisis. Conecte el sitio de recolección venosa a la bolsa de líquido residual.
      NOTA: La solución salina fisiológica no debe contener heparina ni ningún otro anticoagulante.
   2. Conecte las líneas de suministro/retorno de dializado al dializador.
   3. Ponga en marcha el hemodializador y ajuste el caudal a 80-100 mL/min. Expulse todo el aire del circuito de diálisis y del dializador para asegurarse de que todo el sistema de tubos esté lleno de líquido.
   4. Ajuste el plano líquido en las cámaras arteriales y venosas a aproximadamente 2/3 de su capacidad. La solución salina fluye secuencialmente a través de la vía arterial, el dializador, la vía venosa y la bolsa de líquido residual.
5. Inicie la concentración de ultrafiltración.
   1. Después de finalizar el procedimiento de enjuague, cuelgue la bolsa de drenaje que contiene el medio de cultivo filtrado en el soporte de infusión, desinfecte el canal de salida con hisopos de algodón empapados en yodo y conecte el canal de salida de la bolsa de drenaje a un puerto de prebomba usando un equipo de infusión.
   2. Se unen el puerto arterial y el puerto venoso de las líneas de sangre. Establecer un circuito de diálisis aislado por ultrafiltración (ISO-UF, ultrafiltración sin flujo de dializado) (Figura 1).
   3. Ajuste el volumen objetivo de ultrafiltración en la máquina de diálisis para que se corresponda con el volumen total de líquido presente en la bolsa de drenaje. Ajuste el tiempo de diálisis de la ultrafiltración al tiempo mínimo de funcionamiento del sistema. Una vez que los parámetros se hayan establecido correctamente, inicie la ultrafiltración.
      NOTA: Debido al cálculo del sistema de hemodiálisis, el tiempo de diálisis no será demasiado corto, sino que se mantendrá a un ritmo más moderado.
6. Obtener el líquido concentrado.
   1. Después de alcanzar el volumen de deshidratación objetivo, cierre la pinza arterial y conecte el puerto venoso a una bolsa de infusión estéril.
   2. Abra el puerto de prebomba de las líneas de sangre desechables equipadas con un filtro de aire. Activar la bomba de sangre a una velocidad aproximada de 50 mL/min, permitiendo que el líquido dentro de las líneas sanguíneas circule una vez más desde la línea arterial a la vía venosa. Retire todo el líquido concentrado, aproximadamente 158 ml, del circuito y vuelva a la bolsa de infusión estéril.
   3. En la última etapa de concentración, recoja el líquido desperdiciado de la línea de retorno de dializado. Aplique procesos posteriores idénticos a los del medio de cultivo concentrado a la muestra de fluido desperdiciada para controlar cualquier pérdida accidental de sEV que pueda haber ocurrido durante la concentración.
   4. Cierre todas las válvulas y retire la bolsa de infusión, el dializador y todas las vías. Apague la fuente de alimentación y desinfecte la máquina limpiándola.

3. Separación de los sEV con ultracentrífuga

1. Transfiera el medio de cultivo concentrado a tubos de ultracentrífuga y luego equilibrelos.
2. Centrifugar en una ultracentrífuga de grado clínico (ver Tabla de Materiales) a 110.000 × g durante 70 min, luego lavar el pellet con solución salina estéril y proceder con una segunda centrifugación a 110.000 × g durante otros 70 min.
3. Vuelva a suspender los sEV peletizados en una cantidad adecuada de solución salina estéril.
4. Transfiera los sEV a un tubo estéril para realizar más pruebas o guárdelos a -80 °C para su uso futuro.

4. Caracterización de los sEV obtenidos

1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir los sEVs obtenidos (1 μL) con PBS (1 mL) (ver Tabla de Materiales). Ajuste el número de sEV visibles en el campo de visión actual para que esté entre 50 y 200.
   2. Inyecte con cuidado la muestra diluida en el pocillo de la muestra, evitando la introducción de burbujas de aire.
   3. Realice la medición cuando el número de partículas en el campo de visión sea lo más alto y estable posible para todas las posiciones. Los parámetros de análisis son los siguientes: Área máxima: 1000, Área mínima: 10, Brillo mínimo: 30, Longitud de traza: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilidad: 75.
   4. Mida cada muestra al menos tres veces.
2. Análisis de Western blot
   1. Diluir la solución de sEVs en PBS. Utilice un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la tabla de materiales) para medir la concentración de proteínas.
   2. Hervir los sEV en el tampón de muestra a 100 °C durante 5 min.
   3. Prepare un gel de electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio al 12% (SDS-PAGE) (ver Tabla de Materiales). Ensamble el aparato de electroforesis en gel. Cargue cantidades iguales de proteína de cada muestra en los pocillos de gel SDS-PAGE. Ajuste el voltaje de la electroforesis a 80 V para la concentración y 100 V para la separación.
   4. Active la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (ver Tabla de materiales) con metanol durante 1 min, luego remoje la membrana de PVDF en tampón de transferencia antes de continuar con la transferencia a 100 V durante 1 h.
   5. Sumerja la membrana de PVDF en tampón TBST (20 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,1% de Tween 20) que contenga 5% de albúmina sérica bovina (BSA; consulte la Tabla de materiales) y luego bloquee durante 30 minutos.
   6. Incubar la membrana de PVDF con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en un agitador. Los anticuerpos primarios utilizados son los siguientes: anti-CD63 humano (dilución 1:1000), anti-CD9 humano (dilución 1:1000) y anti-HSP70 humano (dilución 1:1000) (ver Tabla de Materiales).
   7. Al día siguiente, lavar la membrana de PVDF con la solución TBST cinco veces durante 5 minutos cada una y luego incubar con anticuerpo secundario conjugado con HRP (dilución 1:10000) (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
   8. Después de lavar con TBST cinco veces, use un reactivo de detección de quimioluminiscencia para obtener imágenes en un sistema de quimioluminiscencia.
3. Microscopía electrónica de transmisión
   1. Agregue una gota de muestra diluida en PBS de 20 μL a un papel encerado. Luego, coloque una rejilla de cobre (consulte la Tabla de materiales) en la gota para que la gota de muestra pueda cubrir la rejilla de cobre y déjela reposar en RT durante 20 minutos.
   2. Absorbe el exceso de líquido con papel de filtro. A continuación, fije las muestras en una solución de 20 μL de paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 2% y fosfato al 0,05 M durante 2 min.
   3. Enjuague la rejilla de cobre tres veces con agua bidestilada, luego tiña con 20 μL de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% durante 1 min en RT.
   4. Absorbe el líquido redundante con papel de filtro. Seque las rejillas durante la noche antes de ser analizadas por microscopía electrónica de transmisión (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Los ajustes recomendados para TEM son los siguientes: Exposición: 1,0 s, Voltaje HT 100,00 kV, Corriente del haz: 50 μA, Tamaño de punto: 1, Modo: TEM. Estos ajustes pueden cambiar siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).

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Resultados

Caracterización morfológica de los sEV
En la etapa final de concentración, también se recolectó el líquido desperdiciado como se describe. El medio concentrado y el fluido desperdiciado fueron ultracentrífugos, respectivamente. Se recolectaron las precipitaciones para el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Como se anticipó, se observó un número significativo de nanovesículas en forma de copa en el g...

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Discusión

Los métodos tradicionales para el aislamiento de sEV incluyen la ultracentrifugación diferencial, la cromatografía de exclusión por tamaño y la precipitación PEG, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Si bien la amalgama de estas técnicas dispares puede mejorar el rendimiento o la pureza de los sEV, los pasos adicionales a menudo introducen más oportunidades para la contaminación de la muestra. Han surgido en el mercado sistemas integrados que afirman extraer sEV a gr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD63	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:1000 dilution
Anti-CD9	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:1000 dilution
Anti-HSP70	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit	Beyotime	P0012
Bloodlines	Fresenius Medical Care	AP16641
Bovine serum albumin 5%	Solarbio	9048-46-8
Cell culture supplement	Helios	HPCPLCGL05	5% (v/v) in cell culture media
Copper grid	Precise	RGRS GP-SMPG-1
Dialyzer	Helixone	FX8	100 kDa MWCO
Drainage bag	CZRUIDE	YLD-01
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)	Dakewe	DKW34-BM20500
Microfiltration membrane	shanghaixingya	WKLM-50-10	0.45 μm and 0.22 μm
Parafilm	Fisher Scientific	1337416
Peristaltic pump	LongerPump	YZ1515x
Phosphate buffer saline	Solarbio	P1022-500ml
Immun-Blot PVDF Membrane	BIO-RAD	1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0015A
Super ECL Plus Western Blotting Substrate	BIOGROUND	BG0001
TBST buffer	Solarbio	T1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman	344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	BIO-RAD
Hemodialyzer	NIKKISO	DBB-27
Nanoparticle Tracking Analysis	ZetaView	PMX120	To measure particle size distribution and particle concentration
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM-1400PLUS	Recommended settings?Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	OPTIMA XPN-100	SW 28Ti SwingingBucket Rotor