Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares Derivadas de Células-Tronco Mesenquimais de Amostras de Grande Volume com Conformidade com GMP para Ensaios Clínicos

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC-sEVs) foram destacadas como uma modalidade de tratamento livre de células com efeitos adversos mínimos. Este estudo fornece um protocolo que combina hemodiálise com ultracentrifugação, reduzindo significativamente o tempo gasto em todo o processo e garantindo a conformidade com os padrões de boas práticas de fabricação (BPF).

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares (sEV) derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC-sEVs) foram destacadas como uma modalidade de tratamento livre de células com efeitos adversos mínimos. Em contraste, os métodos tradicionais de extração, como ultracentrifugação e cromatografia de exclusão de tamanho, são limitados por sua intensidade de tempo, custo e escalabilidade. Para superar essas limitações, propomos um método que integra hemodialisador e ultracentrifugação. Essa abordagem utiliza um dispositivo de hemodiálise com uma membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que concentra seletivamente sEVs enquanto filtra uma infinidade de proteínas, aumentando assim o rendimento e a pureza dos sEVs. Esta etapa inicial de purificação é seguida por ultracentrifugação para refinar ainda mais a preparação de sEV. A integração dessas duas tecnologias não apenas reduziu significativamente o tempo gasto em todo o processo, mas também garantiu a conformidade com os padrões de boas práticas de fabricação (GMP). O método aqui demonstra alta eficiência no isolamento de sEVs de um grande volume de amostras, oferecendo um avanço significativo em relação aos métodos tradicionais. Este protocolo promete acelerar a tradução de terapias baseadas em EV para a prática clínica, fornecendo uma solução escalável, econômica e compatível com GMP.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC-sEVs) são vesículas heterogêneas enriquecidas com múltiplos componentes, como mRNA, micro-RNA, citocinas, lipídios e metabólitos¹. Nos últimos anos, muitos estudos ressaltaram o imenso potencial terapêutico das MSC-sEVs como uma modalidade de tratamento livre de células^com efeitos adversos mínimos 2, mostrando-se promissor na abordagem de um espectro de condições, incluindo envelhecimento, degeneração tecidual, câncer e distúrbio inflamatório ^3,4,5,6. No entanto, um desafio crítico persiste na extração em larga escala de sEV, com os métodos tradicionais provando ser trabalhosamente demorados ou economicamente inviáveis. Além disso, garantir a reprodutibilidade é fundamental para a aplicação clínica e tradução de terapias baseadas em EV⁷. Os pesquisadores precisam urgentemente de um método de purificação que não seja apenas simples e eficiente, mas também compatível com os padrões de boas práticas de fabricação (GMP)⁸.

Os métodos convencionais de purificação, incluindo ultracentrifugação, ultrafiltração, cromatografia de exclusão por tamanho, imunoafinidade e precipitação de polímeros, foram amplamente aplicados em pesquisas anteriores⁹. Em geral, os métodos tradicionais de isolamento de sEV apresentam limitações como baixa taxa de rendimento, pureza comprometida e desafios no cumprimento de rigorosos padrões assépticos. Além disso, pesquisas anteriores relataram o potencial de técnicas promissoras como sistemas microfluídicos^10,11, isolamento magnético sem marcação¹² e isolamento químico covalente¹³ para alcançar um desempenho excepcional. No entanto, a necessidade de equipamentos especializados torna essas técnicas avançadas desafiadoras para a maioria das equipes de pesquisa adotarem. Em resumo, o método eficiente para isolar sEVs de grau GMP de um grande volume de amostras continua sendo um obstáculo crítico, limitando o progresso de várias equipes em pesquisas e aplicações clínicas.

A ultracentrifugação é o método mais amplamente adotado para isolamento de sEV e é reconhecida como o método padrão-ouro^14,15. É uma técnica que aproveita as diferenças de densidade e tamanho para isolar sEVs. Os sEVs isolados são comumente enxaguados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para eliminar contaminantes residuais. Em seguida, um volume apropriado de PBS é geralmente usado para ressuspender os sEVs enxaguados e diferentes concentrações esperadas de sEVs podem ser colhidas controlando o volume de PBS. Além disso, é relatado que a pureza dos sEVs plasmáticos obtidos por ultracentrifugação parece ser melhor do que a dos sEVs plasmáticos isolados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), e os sEVs obtidos por ultracentrifugação têm menores impurezas de partículas extracelulares não vesiculares (NVEPs). Isso também torna a ultracentrifugação a mais amplamente utilizada e difícil de substituir em muitos tratamentos que requerem altas concentrações de sEVs. No entanto, além da qualidade e pureza, a eficiência também é um fator que não pode ser ignorado na extração de sEV em grande volume. Até o momento, uma única rodada de ultracentrifugação pode suportar um volume de amostra de até aproximadamente 600 mL, o que determina que é difícil atender à demanda de extração em larga escala apenas por ultracentrifugação¹⁶.

Um dispositivo de hemodiálise consiste em um módulo baseado em membrana que abriga milhares de fibras ocas. O sangue circula por essas fibras dentro de uma câmara cilíndrica fechada¹⁷. Os constituintes do sangue podem passar seletivamente por essas membranas com base em seu tamanho molecular e concentração iônica. Na clínica, é amplamente utilizado como rim artificial para remover resíduos e excesso de líquidos do sangue dos pacientes 18,19,20. Em outras palavras, o hemodialisador também tem o potencial de concentrar amostras de grande volume, contando com um processo semelhante à filtração de fluxo tangencial (TFF). Na recente diretriz emitida pela Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), os concentrados de sEV são considerados adequados para amostras de grande volume, como meio de cultura de células. Após décadas de desenvolvimento, os hemodialisadores foram amplamente adotados em hospitais, apoiados por uma abundância de consumíveis maduros e um grupo de operadores qualificados, o que torna mais fácil manter a amostra estéril.

Este estudo apresenta um método de purificação de sEV baseado em hemodialisador e ultracentrífuga compatível com GMPs. Aqui, escolhemos dialisadores de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa, que demonstraram capturar efetivamente sEVs e filtrar várias proteínas²². A ultracentrifugação também fornece uma etapa para purificação adicional. O trabalho demonstra que o hemodialisador é igualmente adequado para a concentração de sEVs. Este protocolo permite que os pesquisadores isolem sEVs de amostras de grande volume de forma eficiente. Registramos o ensaio clínico no Registro Chinês de Ensaios Clínicos (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), que ainda está em andamento e ainda não foi concluído. Embora os dados clínicos não estejam prontamente disponíveis para publicação neste momento, um método confiável, em larga escala, eficiente e compatível para a produção de sEVs, conforme relatado neste protocolo, é um pré-requisito para a realização de ensaios pré-clínicos e clínicos.

Protocolo

O protocolo foi aprovado e conduzido de acordo com o Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Southwest Hospital.

1. Remoção de detritos celulares do meio de cultura

NOTA: Os procedimentos abaixo devem ser operados em um ambiente compatível com GMP, especialmente quando as amostras podem ser diretamente expostas ao meio ambiente.

1. Dada a exigência de ausência de microbiota, certifique-se de que o filtro e o tubo de borracha sejam autoclavados para uma esterilização eficaz. Certifique-se de que todos os outros consumíveis que possam encontrar o meio de cultura estejam estéreis e em embalagens lacradas. Execute o processo de remoção de detritos celulares em um gabinete de fluxo laminar.
2. Monte a membrana de filtração de 0,45 μm e 0,22 μm no aparelho filtrante. Conecte uma bomba peristáltica (consulte a Tabela de Materiais) e o aparelho de filtro com o tubo de borracha. Posicione a membrana de 0,45 μm acima da membrana de 0,22 μm; caso contrário, pode diminuir a eficiência da filtragem (Figura 1). Preste atenção à distinção entre os lados frontal e traseiro da membrana de microfiltração.
3. Ligue a bomba peristáltica para a filtração. Alimentado pela bomba, o meio basal de células-tronco mesenquimais (MSCBM) com suplemento de 5% (ver Tabela de Materiais) passa pelo filtro por uma extremidade, e o meio de cultura filtrado pode ser obtido na outra extremidade do filtro, conforme mostrado na (Figura 1). Recolher o meio de cultura filtrado num saco de drenagem com canais duplos. Mantenha a integridade do sistema de filtração otimizando a velocidade da bomba peristáltica e substituindo a membrana de filtração conforme necessário.
4. Após a conclusão da filtração, feche a válvula de entrada no saco de drenagem e feche-o com parafilme (consulte a Tabela de Materiais). Prossiga para o passo seguinte ou armazene temporariamente o meio de cultura celular filtrado a 4 °C.

2. Concentrando o meio de cultura filtrado com um hemodialisador

NOTA: Evite usar o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo vermelho de fenol em cultura de células, pois o detector de vazamento de sangue no hemodialisador será ativado ou desligue o detector de vazamento de sangue no ambiente do hemodialisador.

1. Prepare os consumíveis.
   1. Prepare linhagens, membranas de polissulfona de alto fluxo MWCO de 100 kDa, dialisador de sangue, conjunto de infusão, solução salina fisiológica, bolsa de infusão, solução de iodo e cotonetes antes da concentração (consulte a Tabela de Materiais).
2. Ligue o sistema e faça o autoteste.
   1. Verifique a conexão do cabo de alimentação do hemodialisador e ligue a alimentação principal.
   2. Aguarde até que a máquina conclua todo o procedimento de autodiagnóstico.
3. Instale as linhagens e o dialisador.
   1. Verifique as datas de validade das linhagens descartáveis e do dialisador de sangue, garantindo a integridade de sua embalagem externa e verificando se há danos nas linhagens.
   2. Instale a tubulação na mesma direção do fluxo sanguíneo no circuito extracorpóreo, fechando sequencialmente as válvulas de ramificação para formar uma circulação de circuito fechado.
4. Inicie o procedimento de enxágue.
   1. Use um conjunto de infusão para conectar a solução salina fisiológica (sem heparina) de um tubo antes da bomba ao circuito de diálise. Conecte o local de coleta venosa ao saco de fluido residual.
      NOTA: A solução salina fisiológica não deve conter heparina ou quaisquer outros anticoagulantes.
   2. Conecte as linhas de suprimento/retorno do dialisado ao dialisador.
   3. Inicie o hemodialisador e ajuste a taxa de fluxo para 80-100 mL / min. Expulse todo o ar do circuito de diálise e do dialisador para garantir que todo o sistema de tubulação esteja cheio de fluido.
   4. Ajuste o plano líquido nas câmaras arterial e venosa para aproximadamente 2/3 cheio. A solução salina flui sequencialmente através da linha arterial, do dialisador, da linha venosa e da bolsa de fluido residual.
5. Inicie a concentração de ultrafiltração.
   1. Depois de terminar o procedimento de enxágue, pendure a bolsa de drenagem contendo o meio de cultura filtrado no suporte de infusão, desinfete o canal de saída com cotonetes embebidos em iodo e conecte o canal de saída da bolsa de drenagem a uma porta de pré-bomba usando um conjunto de infusão.
   2. Junte a porta arterial e a porta venosa das linhagens. Estabelecer um circuito de diálise de ultrafiltração (ISO-UF, ultrafiltração sem fluxo de dialisato) (Figura 1).
   3. Ajuste o volume alvo de ultrafiltração na máquina de diálise para corresponder ao volume total de fluido presente na bolsa de drenagem. Defina o tempo de diálise da ultrafiltração para o tempo operacional mínimo do sistema. Depois que os parâmetros forem definidos com sucesso, inicie a ultrafiltração.
      NOTA: Devido ao cálculo do sistema de hemodiálise, o tempo de diálise não será muito curto, mas será mantido em uma taxa mais moderada.
6. Obtenha o fluido concentrado.
   1. Depois de atingir o volume de desidratação alvo, feche o grampo arterial e conecte a porta venosa a uma bolsa de infusão estéril.
   2. Abra a porta de pré-bomba das linhas de sangue descartáveis equipadas com um filtro de ar. Ative a bomba de sangue a uma velocidade de aproximadamente 50 mL/min, permitindo que o fluido dentro das linhagens circule mais uma vez da linha arterial para a linha venosa. Retraia todo o fluido concentrado, aproximadamente 158 mL, do circuito de volta para a bolsa de infusão estéril.
   3. Na fase final da concentração, recolher o líquido desperdiçado da linha de retorno do dialisato. Aplique processos subsequentes idênticos aos do meio de cultura concentrado à amostra de fluido desperdiçada para monitorar qualquer perda acidental de sEVs que possa ter ocorrido durante a concentração.
   4. Feche todas as válvulas e remova a bolsa de infusão, o dialisador e todas as linhas. Desligue a fonte de alimentação e desinfete a máquina limpando-a.

3. Separando os sEVs com ultracentrífuga

1. Transfira o meio de cultura concentrado para tubos de ultracentrífuga e equilibre-os.
2. Centrifugue em uma ultracentrífuga de grau clínico (consulte a Tabela de Materiais) a 110.000 × g por 70 min, depois lave o pellet com solução salina estéril e prossiga com uma segunda centrifugação a 110.000 × g por mais 70 min.
3. Ressuspenda os sEVs peletizados em uma quantidade apropriada de solução salina estéril.
4. Transfira os sEVs para um tubo estéril para testes adicionais ou armazene-os a -80 °C para uso futuro.

4. Caracterização dos sEVs obtidos

1. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluir os sEVs obtidos (1 μL) com PBS (1 mL) (ver Tabela de Materiais). Ajuste o número de sEVs visíveis no campo de visão atual para ficar entre 50 e 200.
   2. Injete cuidadosamente a amostra diluída no poço da amostra, evitando a introdução de bolhas de ar.
   3. Realize a medição quando o número de partículas no campo de visão for o mais alto e estável possível para todas as posições. Os parâmetros de análise são os seguintes: Área máxima: 1000, Área mínima: 10, Brilho mínimo: 30, Comprimento do traço: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilidade: 75.
   4. Meça cada amostra pelo menos três vezes.
2. Análise de Western blotting
   1. Diluir a solução de sEVs em PBS. Use um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (consulte a Tabela de Materiais) para medir a concentração de proteína.
   2. Ferva os sEVs no tampão de amostra a 100 °C por 5 min.
   3. Prepare um gel de eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida a 12% de sódio (SDS-PAGE) (consulte a Tabela de Materiais). Monte o aparelho de eletroforese em gel. Carregue quantidades iguais de proteína de cada amostra nos poços de gel SDS-PAGE. Defina a tensão da eletroforese para 80 V para concentração e 100 V para separação.
   4. Ative a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (consulte a Tabela de Materiais) com metanol por 1 min e, em seguida, mergulhe a membrana de PVDF em tampão de transferência antes de prosseguir com a transferência a 100 V por 1 h.
   5. Mergulhe a membrana de PVDF em tampão TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) contendo 5% de albumina de soro bovino (BSA; ver Tabela de Materiais) e, em seguida, bloqueie por 30 min.
   6. Incubar a membrana de PVDF com o anticorpo primário durante a noite a 4 °C num agitador. Os anticorpos primários usados são os seguintes: anti-CD63 humano (diluição 1:1000), anti-CD9 humano (diluição 1:1000) e anti-HSP70 humano (diluição 1:1000) (ver Tabela de Materiais).
   7. No dia seguinte, lave a membrana de PVDF com solução de TBST cinco vezes por 5 min cada e depois incube com anticorpo secundário conjugado com HRP (diluição 1:10000) (consulte a Tabela de Materiais) à temperatura ambiente (RT) por 1 h.
   8. Depois de lavar com TBST cinco vezes, use um reagente de detecção de quimioluminescência para obter imagens em um sistema de quimioluminescência.
3. Microscopia eletrônica de transmissão
   1. Adicione uma gota de amostra diluída em PBS de 20 μL a um papel encerado. Em seguida, coloque uma grade de cobre (consulte a Tabela de Materiais) na gota para que a gota de amostra possa cobrir a grade de cobre e deixe-a repousar em RT por 20 min.
   2. Absorva o excesso de líquido com papel de filtro. Em seguida, fixe as amostras em uma solução de 20 μL de paraformaldeído a 2%, glutaraldeído a 2% e solução de fosfato 0,05 M por 2 min.
   3. Enxágue a grade de cobre três vezes com água bidestilada e, em seguida, comente com 20 μL de ácido fosfotúngstico (PTA) a 2% por 1 min em RT.
   4. Absorva o líquido redundante com papel de filtro. Seque as grades durante a noite antes de serem analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: As configurações recomendadas para TEM são as seguintes: Exposição: 1.0 s, Tensão HT 100.00 kV, Corrente do feixe: 50 μA, Tamanho do ponto: 1, Modo: TEM. Essas configurações podem mudar de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de materiais).

Resultados

Caracterização morfológica de sEVs
No estágio final de concentração, o fluido desperdiçado também foi coletado conforme descrito. O meio concentrado e o fluido desperdiçado foram ultracentrifugados, respectivamente. As precipitações foram coletadas para análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET). Como previsto, um número significativo de nanovesículas em forma de taça foi observado no grupo do meio concentr...

Discussão

Os métodos tradicionais para o isolamento de sEVs incluem ultracentrifugação diferencial, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação de PEG, cada um com seus próprios méritos e deméritos. Embora a fusão dessas técnicas díspares possa aumentar o rendimento ou a pureza dos sEVs, etapas adicionais geralmente introduzem mais oportunidades de contaminação da amostra. Existem sistemas integrados que alegam extrair sEVs em massa e aderir aos padrões GMP surgiram no merca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD63	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:1000 dilution
Anti-CD9	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:1000 dilution
Anti-HSP70	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit	Beyotime	P0012
Bloodlines	Fresenius Medical Care	AP16641
Bovine serum albumin 5%	Solarbio	9048-46-8
Cell culture supplement	Helios	HPCPLCGL05	5% (v/v) in cell culture media
Copper grid	Precise	RGRS GP-SMPG-1
Dialyzer	Helixone	FX8	100 kDa MWCO
Drainage bag	CZRUIDE	YLD-01
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)	Dakewe	DKW34-BM20500
Microfiltration membrane	shanghaixingya	WKLM-50-10	0.45 μm and 0.22 μm
Parafilm	Fisher Scientific	1337416
Peristaltic pump	LongerPump	YZ1515x
Phosphate buffer saline	Solarbio	P1022-500ml
Immun-Blot PVDF Membrane	BIO-RAD	1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0015A
Super ECL Plus Western Blotting Substrate	BIOGROUND	BG0001
TBST buffer	Solarbio	T1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman	344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	BIO-RAD
Hemodialyzer	NIKKISO	DBB-27
Nanoparticle Tracking Analysis	ZetaView	PMX120	To measure particle size distribution and particle concentration
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM-1400PLUS	Recommended settings：Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	OPTIMA XPN-100	SW 28Ti SwingingBucket Rotor