著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

間葉系幹細胞(MSC-sEV)に由来する小さな細胞外小胞は、副作用が最小限に抑えられた無細胞治療法として強調されています。この研究では、血液透析と超遠心分離を組み合わせたプロトコルを提供し、プロセス全体に費やす時間を大幅に短縮し、GMP(Good Manufacturing Practice)基準への準拠を確保します。

要約

間葉系幹細胞(MSC-sEV)に由来する小さな細胞外小胞(sEV)は、副作用が最小限に抑えられた無細胞治療法として強調されています。対照的に、超遠心分離クロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィーなどの従来の抽出法は、時間強度、コスト、およびスケーラビリティによって制限されています。これらの制限を克服するために、血液透析器と超遠心分離を統合した方法を提案します。このアプローチでは、100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)膜を備えた血液透析装置を利用し、sEVを選択的に濃縮し、多数のタンパク質をろ過することで、sEVの収量と純度を向上させます。この最初の精製ステップに続いて、超遠心分離を行い、sEV調製をさらに精製します。これら2つのテクノロジーの統合により、プロセス全体に費やす時間が大幅に短縮されただけでなく、GMP(Good Manufacturing Practice)基準への準拠も確保されました。この方法は、大量のサンプルからsEVを高い効率で分離できることを示しており、従来の方法に比べて大幅な進歩を遂げています。このプロトコルは、スケーラブルで費用対効果の高いGMP準拠のソリューションを提供することにより、EVベースの治療法の臨床診療への転換を加速することが期待されています。

概要

間葉系幹細胞(MSC-sEV)に由来する小さな細胞外小胞は、mRNA、マイクロRNA、サイトカイン、脂質、代謝物などの複数の成分が豊富な不均一な小胞です1。近年、多くの研究により、MSC-sEVは、副作用を最小限に抑えた無細胞治療法として大きな治療可能性を秘めていることが強調されており2、老化、組織変性、がん、炎症性疾患3,4,5,6などのさまざまな疾患に対処することが期待されています.それにもかかわらず、sEVの大規模な抽出には重大な課題が残っており、従来の方法は手間がかかるか、経済的に実現不可能であることが証明されています。さらに、再現性を確保することは、EVベースの治療法の臨床応用と翻訳にとって最も重要です7。研究者は、シンプルで効率的であるだけでなく、GMP(Good Manufacturing Practice)基準8に準拠した精製方法を切実に必要としています。

超遠心分離、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫親和性、ポリマー沈殿などの従来の精製法は、これまでの研究で広く適用されてきました9。一般に、従来のsEV単離法では、歩留まりが低い、純度が損なわれる、厳しい無菌基準を満たすことが難しいなどの制限があります。さらに、これまでの研究では、マイクロ流体システム10,11、ラベルフリー磁気絶縁12、共有化学分離13などの有望な技術が優れた性能を達成できる可能性が報告されています。しかし、特殊な機器が必要なため、これらの高度な技術を採用することは、大多数の研究チームにとって困難です。要約すると、大量のサンプルからGMPグレードのsEVを効率的に分離する方法は依然として重大な障害であり、研究と臨床アプリケーションの両方で多数のチームの進行を制限しています。

超遠心分離は、sEV分離に最も広く採用されている方法であり、ゴールドスタンダードの方法として認識されています14,15。これは、密度とサイズの違いを利用してsEVを分離する手法です。単離されたsEVは、通常、残留汚染物質を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすがれます。次に、通常、適切な量のPBSを使用してすすぎたsEVを再懸濁し、PBSの量を制御することで、予想されるさまざまな濃度のsEVを回収できます。さらに、超遠心分離法で得られた血漿sEVの純度は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で単離された血漿sEVよりも優れていると考えられ、超遠心分離法で得られたsEVは、非小胞性細胞外粒子(NVEP)不純物が少ないことが報告されています。また、これにより、超遠心分離は最も広く使用されており、高濃度のsEVを必要とする多くの治療で置き換えることが困難です。しかし、品質と純度に加えて、効率も大量のsEV抽出において無視できない要素です。これまでのところ、1回の超遠心分離で約600mLのサンプル量をサポートできるため、超遠心分離だけでは大規模な抽出の要求を満たすことは困難であると判断されています16。

血液透析装置は、何千もの中空糸を収容する膜ベースのモジュールで構成されています。血液は、密閉された円筒形のチャンバー17内でこれらの繊維を循環する。血液の成分は、分子サイズとイオン濃度に基づいて、これらの膜を選択的に通過できます。クリニックでは、患者の血液から老廃物や余分な水分を取り除くための人工腎臓として広く使用されています18,19,20。言い換えれば、血液透析器は、タンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)と同様のプロセスに依存して、大量のサンプルを濃縮する可能性も秘めています。International Society for Extracellular Vesicles(ISEV)が発行した最近のガイドラインでは、sEV濃縮物は細胞培養培地などの大容量サンプルに適していると考えられています。何十年にもわたる開発を経て、血液透析器は病院で広く採用され、豊富な成熟した消耗品と熟練したオペレーターのプールに支えられ、サンプルを無菌状態に保つことが容易になります。

本研究では、GMPに適合した血液透析器と超遠心分離機を用いたsEV精製法について紹介する。ここでは、100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)のダイアライザーを選択します。これは、sEVを効果的に捕捉し、多数のタンパク質をろ過することが実証されています22。超遠心分離は、さらなる精製のためのステップも提供します。この研究は、血液透析器がsEVの濃縮に等しく適していることを示しています。このプロトコルにより、研究者は大量のサンプルからsEVを効率的に分離できます。臨床試験は、まだ進行中で完了していない中国の臨床試験レジストリ(ChiCTR、NO.ChiCTR2200059018)に登録されています。現時点では臨床データをすぐに公開することはできませんが、このプロトコルで報告されているように、信頼性が高く、大規模で、効率的で、準拠したsEVの製造方法が、前臨床試験および臨床試験を実施するための前提条件です。

プロトコル

このプロトコルは、サウスウェスト病院のヒト研究倫理委員会に従って承認され、実施されました。

1. 培地からの細胞残骸の除去

注:以下の手順は、特にサンプルが環境に直接さらされる可能性がある場合は、GMPに準拠した環境で操作する必要があります。

  1. 微生物叢のない要件を考えると、効果的な滅菌のためにフィルターとゴムチューブがオートクレーブされていることを確認してください。培地に遭遇する可能性のある他のすべての消耗品が無菌で、密封されたパッケージに入っていることを確認してください。層流キャビネット内の細胞破片を除去するプロセスを実行します。
  2. 0.45 μmおよび0.22 μmのろ過膜をフィルター装置に組み立てます。蠕動ポンプ( 材料の表を参照)とフィルター装置をゴムチューブで接続します。0.45 μmのメンブレンを0.22 μmのメンブレンの上に配置します。そうしないと、ろ過効率が低下する可能性があります(図1)。精密ろ過膜の表側と裏側を区別することに注意してください。
  3. ろ過用の蠕動ポンプを始動します。ポンプを動力源として、5%のサプリメントを含む間葉系幹細胞基底培地(MSCBM)( 材料表を参照)が一方の端からフィルターを通過し、ろ過された培地はフィルターのもう一方の端で得ることができます(図1)。ろ過した培地を、デュアルチャネルを備えたドレナージバッグに集めます。蠕動ポンプ速度を最適化し、必要に応じてろ過膜を交換することにより、ろ過システムの完全性を維持します。
  4. ろ過が完了したら、ドレナージバッグのインレットバルブを閉じ、さらにパラフィルムで密封します(材料の表を参照)。次のステップに進むか、ろ過した細胞培養培地を4°Cで一時的に保存します。

2. ろ過した培地を血液透析器で濃縮

注:血液透析器の血液漏れ検出器が作動するか、血液透析器の設定で血液漏れ検出器をシャットダウンするため、細胞培養でフェノールレッドを含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の使用は控えてください。

  1. 消耗品を準備します。
    1. 濃縮前に、血液系統、100 kDa MWCO高フラックスポリスルホン膜、血液透析器、輸液セット、生理食塩水、輸液バッグ、ヨウ素溶液、綿棒を準備します( 材料の表を参照)。
  2. システムの電源を入れ、セルフテストを行います。
    1. 血液透析器の電源ケーブルの接続を確認し、主電源を入れます。
    2. マシンが自己診断手順全体を完了するのを待ちます。
  3. 血液系統と透析器を取り付けます。
    1. 使い捨ての血液系統と血液透析器の有効期限を確認し、外装の完全性を確保し、ラインに損傷がないか確認します。
    2. 体外回路の血流と同じ方向にチューブを取り付け、分岐弁を順次閉じて閉ループ循環を形成します。
  4. すすぎ手順を開始します。
    1. 輸液セットを使用して、ポンプの前のチューブから生理食塩水(ヘパリンなし)を透析回路に接続します。静脈採取場所を廃液バッグに接続します。
      注:生理食塩水には、ヘパリンやその他の抗凝固剤が含まれていてはなりません。
    2. 透析液の供給/戻りラインをダイアライザーに接続します。
    3. 血液透析器を始動し、流量を80〜100mL / minに設定します。透析回路と透析器からすべての空気を排出して、チューブシステム全体が液体で満たされるようにします。
    4. 動脈室と静脈室の液体面を約2/3に調整します。.生理食塩水は、動脈ライン、透析器、静脈ライン、廃液バッグを順番に流れます。
  5. 限外ろ過濃縮を開始します。
    1. リンス手順が終了したら、ろ過した培地が入ったドレナージバッグを注入スタンドに吊るし、ヨウ素を染み込ませた綿棒で出力チャネルを消毒し、ドレナージバッグの出力チャネルを注入セットを使用してプレポンプポートに接続します。
    2. 血統の動脈ポートと静脈ポートを結合します。孤立した限外ろ過(ISO-UF、透析液の流れのない限外ろ過)透析回路を確立します(図1)。
    3. 透析装置の限外ろ過目標量を、ドレナージバッグ内に存在する液体の総量に対応するように調整します。限外ろ過の透析時間をシステムの最小運転時間に設定します。パラメータが正常に設定されたら、限外ろ過を開始します。
      注:血液透析システムの計算により、透析時間は短すぎず、より緩やかな速度で維持されます。
  6. 濃縮された液体を入手します。
    1. 目標の脱水量を達成した後、動脈クランプを閉じ、静脈ポートを滅菌輸液バッグに接続します。
    2. エアフィルターを装備した使い捨て血液ラインのプレポンプポートを開きます。血液ポンプを約50mL /分の速度で作動させ、血液ライン内の液体が動脈ラインから静脈ラインに再び循環できるようにします。濃縮されたすべての液体(約158 mL)を回路から滅菌注入バッグに戻します。.
    3. 濃縮の後期に、透析液リターンラインから無駄な液体を回収します。濃縮培地と同じプロセスを無駄な液体サンプルに適用し、濃縮中に発生した可能性のあるsEVの偶発的な損失を監視します。
    4. すべてのバルブを閉じ、輸液バッグ、透析器、およびすべてのラインを取り外します。電源を切り、機械を拭き取るように消毒してください。

3. 超遠心分離機によるsEVの分離

  1. 濃縮した培地を超遠心チューブに移し、バランスを取ります。
  2. 臨床グレードの超遠心分離機(材料表を参照)で110,000 × gで70分間遠心分離した後、ペレットを滅菌生理食塩水で洗浄し、110,000 gでさらに70分間×2回目の遠心分離に進みます。
  3. ペレット化したsEVを適量の滅菌生理食塩水に再懸濁します。
  4. sEVを滅菌チューブに移してさらに試験するか、将来の使用のために-80°Cで保管します。

4. 得られたsEVの特性評価

  1. ナノ粒子追跡分析(NTA)
    1. 得られたsEV(1 μL)をPBS(1 mL)で希釈します( 材料の表を参照)。現在の視野に表示される sEV の数を 50 から 200 の間で調整します。
    2. 希釈したサンプルをサンプルウェルに慎重に注入し、気泡の侵入を避けます。
    3. 視野内の粒子の数がすべての位置で可能な限り多く、安定しているときに測定を実行してください。分析パラメータは、最大面積:1000、最小面積:10、最小輝度:30、トレース長:15、温度:25°C、感度:75です。
    4. 各サンプルを少なくとも3回測定します。
  2. ウェスタンブロッティング分析
    1. sEV溶液をPBSで希釈します。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を使用して、タンパク質濃度を測定します。
    2. sEVをサンプルバッファー中で100°Cで5分間煮沸します。
    3. 12%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルを調製します( 材料の表を参照)。ゲル電気泳動装置を組み立てます。各サンプルのタンパク質を同量SDS-PAGEゲルウェルにロードします。電気泳動の電圧を濃度は80V、分離は100Vに設定します。
    4. ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(材料表を参照)をメタノールで1分間活性化し、PVDFメンブレンをトランスファーバッファーに浸してから、100Vで1時間トランスファーに進みます。
    5. PVDFメンブレンを、5%ウシ血清アルブミン(BSA;材料表を参照)を含むTBSTバッファー(20 mM Tris、150 mM NaCl、および0.1% Tween 20)に浸し、30分間ブロックします。
    6. PVDFメンブレンを一次抗体と混合器で4°Cで一晩インキュベートします。使用した主な抗体は、ヒト抗CD63抗体(1:1000希釈)、ヒト抗CD9抗体(1:1000希釈)、ヒト抗HSP70抗体(1:1000希釈)です( 材料表参照)。
    7. 翌日、PVDFメンブレンをTBST溶液で5回、各5分間洗浄し、HRP標識二次抗体(1:10000希釈)( 材料表参照)と室温(RT)で1時間インキュベートします。
    8. TBSTで5回洗浄した後、化学発光検出試薬を使用して化学発光システム上でイメージングします。
  3. 透過型電子顕微鏡
    1. PBSで希釈した20μLのサンプル滴をパラフィンペーパーに加えます。次に、銅グリッド( 材料の表を参照)を液滴の上に置き、サンプル液滴が銅グリッドを覆うようにし、室温で20分間放置します。
    2. 濾紙で余分な液体を吸収します。次に、サンプルを2%パラホルムアルデヒド、2%グルタルアルデヒド、および0.05 Mリン酸溶液の20 μL溶液に2分間固定します。
    3. 銅グリッドを二重蒸留水で3回すすぎ、20μLの2%リンタングステン酸(PTA)でRTで1分間染色します。
    4. 濾紙で余分な液体を吸収します。透過型電子顕微鏡で分析する前に、グリッドを一晩乾燥させます( 材料の表を参照)。
      注:TEMの推奨設定は次のとおりです:露光:1.0秒、HT電圧100.00 kV、ビーム電流:50μA、スポットサイズ:1、モード:TEM。これらの設定は、製造元の指示に従って変更される場合があります( 資料の表を参照)。

結果

sEVの形態学的特性評価
濃縮の最終段階では、説明されているように、無駄な液体も収集されました。濃縮された培地と廃液をそれぞれ超遠心分離しました。透過型電子顕微鏡(TEM)分析のために沈殿物を収集しました。予想通り、濃縮された中分子グループでは、かなりの数のカップ状のナノベシクルが観察されました(

ディスカッション

従来のsEVの単離方法には、示差超遠心分離法、サイズ排除クロマトグラフィー、PEG沈殿法などがあり、それぞれに長所と短所があります。これらの異なる技術の融合により、sEVの収率や純度が向上する可能性がありますが、追加のステップにより、サンプル汚染の機会が増えることがよくあります。sEVを大量に抽出し、GMP基準を遵守すると主張する統合システムが市...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国立科学基金会(822101167からBBへ)、重慶自然科学基金会(CSTB2022NSCQ-MSX0020からBBへ)、重慶のPhD「Through Train」科学研究プロジェクト(CSTB2022BSXM-JCX0031からBBへ)、および中国国立科学基金会(82271132からYLへ)からの資金提供を受けて行われました。腎臓内科、第一附属病院、第三軍事医科大学(陸軍医科大学)、および病理学研究所および南西癌センター、南西病院、第三軍事医科大学(陸軍医科大学)の設備と技術サポートの協力に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 dilution
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 dilution
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay KitBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CareAP16641
Bovine serum albumin 5%Solarbio9048-46-8
Cell culture supplementHeliosHPCPLCGL055% (v/v) in cell culture media
Copper gridPreciseRGRS GP-SMPG-1
DialyzerHelixoneFX8100 kDa MWCO
Drainage bagCZRUIDEYLD-01
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Microfiltration membraneshanghaixingyaWKLM-50-100.45 μm and 0.22 μm 
ParafilmFisher Scientific1337416
Peristaltic pumpLongerPumpYZ1515x
Phosphate buffer salineSolarbioP1022-500ml
Immun-Blot PVDF MembraneBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
TBST bufferSolarbioT1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mLBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Nanoparticle Tracking AnalysisZetaViewPMX120To measure particle size
distribution and particle
concentration
Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM-1400PLUSRecommended settings：Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti SwingingBucket Rotor

参考文献

  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17 (2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199 (2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605 (2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179 (2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480 (2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522 (2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971 (2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604 (2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871 (2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907 (2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237 (2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296 (2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128 (2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932 (2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892 (2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186 (2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

JoVE 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved