Isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali da campioni di grande volume con conformità GMP per studi clinici

Riepilogo

Piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento priva di cellule con effetti avversi minimi. Questo studio fornisce un protocollo che combina l'emodialisi con l'ultracentrifugazione, riducendo significativamente il tempo dedicato all'intero processo e garantendo la conformità agli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEVs) sono state evidenziate come una modalità di trattamento cell-free con effetti avversi minimi. Al contrario, i metodi di estrazione tradizionali come l'ultracentrifugazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale sono limitati dall'intensità del tempo, dal costo e dalla scalabilità. Per superare questi limiti, proponiamo un metodo che integra un emodializzatore e un'ultracentrifugazione. Questo approccio utilizza un dispositivo per emodialisi con una membrana di cut-off del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa, che concentra selettivamente le sEV filtrando una pletora di proteine, migliorando così la resa e la purezza delle sEV. Questa fase iniziale di purificazione è seguita dall'ultracentrifugazione per affinare ulteriormente la preparazione della sEV. L'integrazione di queste due tecnologie non solo ha ridotto significativamente il tempo dedicato all'intero processo, ma ha anche garantito la conformità agli standard GMP (Good Manufacturing Practice). Il metodo dimostra un'elevata efficienza nell'isolamento delle sEV da un grande volume di campioni, offrendo un progresso significativo rispetto ai metodi tradizionali. Questo protocollo promette di accelerare la traduzione delle terapie basate sulle vescicole extracellulari nella pratica clinica, fornendo una soluzione scalabile, economica e conforme alle GMP.

Introduzione

Le piccole vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-sEV) sono vescicole eterogenee arricchite con molteplici componenti come mRNA, micro-RNA, citochine, lipidi e metaboliti¹. Negli ultimi anni, molti studi hanno sottolineato l'immenso potenziale terapeutico delle MSC-sEV come modalità di trattamento senza cellule con effetti avversi minimi², dimostrandosi promettenti nell'affrontare uno spettro di condizioni, tra cui l'invecchiamento, la degenerazione tissutale, il cancro e il disturbo infiammatorio ^3,4,5,6. Ciononostante, persiste una sfida critica nell'estrazione su larga scala di sEV, con i metodi tradizionali che si dimostrano laboriosamente dispendiosi in termini di tempo o economicamente irrealizzabili. Inoltre, garantire la riproducibilità è fondamentale per l'applicazione clinica e la traduzione delle terapie basate su EV⁷. I ricercatori hanno un disperato bisogno di un metodo di purificazione che non sia solo semplice ed efficiente, ma anche conforme agli standard di buona pratica di fabbricazione (GMP)⁸.

I metodi di purificazione convenzionali, tra cui l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale, l'immunoaffinità e la precipitazione polimerica, sono stati ampiamente applicati in ricerche precedenti⁹. In generale, i metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV presentano limitazioni come basso tasso di resa, purezza compromessa e sfide nel soddisfare rigorosi standard asettici. Inoltre, ricerche precedenti hanno riportato il potenziale di tecniche promettenti come i sistemi microfluidici^10,11, l'isolamento magnetico senza marcatura¹² e l'isolamento chimico covalente¹³ per ottenere prestazioni eccezionali. Tuttavia, la necessità di attrezzature specializzate rende queste tecniche avanzate difficili da adottare per la maggior parte dei team di ricerca. In sintesi, il metodo efficiente per isolare le sEV di grado GMP da un grande volume di campioni rimane un ostacolo critico, limitando il progresso di numerosi team sia nella ricerca che nelle applicazioni cliniche.

L'ultracentrifugazione è il metodo più adottato per l'isolamento delle sEV ed è riconosciuto come il metodo gold standard^14,15. Si tratta di una tecnica che sfrutta le differenze di densità e dimensioni per isolare le sEV. Le sEV isolate vengono comunemente risciacquate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per eliminare i contaminanti residui. Quindi, un volume appropriato di PBS viene generalmente utilizzato per risospendere le sEV risciacquate e diverse concentrazioni attese di sEV possono essere raccolte controllando il volume di PBS. Inoltre, è stato riportato che la purezza delle sEV plasmatiche ottenute mediante ultracentrifugazione sembra essere migliore di quella delle sEV plasmatiche isolate mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e le sEV ottenute mediante ultracentrifugazione hanno impurità inferiori alle particelle extracellulari non vescicolari (NVEP). Questo rende anche l'ultracentrifugazione la più utilizzata e difficile da sostituire in molti trattamenti che richiedono alte concentrazioni di sEV. Tuttavia, oltre alla qualità e alla purezza, anche l'efficienza è un fattore che non può essere ignorato nell'estrazione di grandi volumi di sEV. Finora, un singolo ciclo di ultracentrifugazione può supportare un volume di campione fino a circa 600 mL, il che determina che è difficile soddisfare la domanda di estrazione su larga scala con la sola ultracentrifugazione¹⁶.

Un dispositivo per emodialisi è costituito da un modulo basato su membrana che ospita migliaia di fibre cave. Il sangue circola attraverso queste fibre all'interno di una camera cilindrica chiusa¹⁷. I costituenti del sangue possono passare selettivamente attraverso queste membrane in base alle loro dimensioni molecolari e alla concentrazione ionica. In clinica, è ampiamente utilizzato come rene artificiale per rimuovere i prodotti di scarto e i liquidi in eccesso dal sangue dei pazienti 18,19,20. In altre parole, l'emodializzatore ha anche il potenziale per concentrare campioni di grandi volumi, basandosi su un processo simile alla filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Nelle recenti linee guida emesse dall'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), i concentrati di sEV sono considerati adatti per campioni di grande volume, come i terreni di coltura cellulare. Dopo decenni di sviluppo, gli emodializzatori sono stati ampiamente adottati negli ospedali, supportati da un'abbondanza di materiali di consumo maturi e da un pool di operatori qualificati, che rende più facile mantenere sterile il campione.

Questo studio presenta un metodo di purificazione sEV basato su un emodializzatore e un'ultracentrifuga compatibile con le GMP. In questo caso, abbiamo scelto dializzatori con cut-off del peso molecolare (MWCO) di 100 kDa, che hanno dimostrato di catturare efficacemente le sEV e filtrare numerose proteine²². L'ultracentrifugazione fornisce anche una fase per un'ulteriore purificazione. Il lavoro dimostra che l'emodializzatore è ugualmente adatto per la concentrazione di sEVs. Questo protocollo consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente le sEV da campioni di grandi volumi. Abbiamo registrato lo studio clinico nel registro cinese degli studi clinici (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), che è ancora in corso e non è stato ancora completato. Sebbene i dati clinici non siano prontamente disponibili per la pubblicazione in questo momento, un metodo affidabile, su larga scala, efficiente e conforme per la produzione di sEV come riportato in questo protocollo è un prerequisito per condurre studi preclinici e clinici.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato e condotto in conformità con il Comitato Etico per la Ricerca Umana del Southwest Hospital.

1. Rimozione dei detriti cellulari dal terreno di coltura

NOTA: Le procedure seguenti devono essere eseguite in un ambiente conforme alle GMP, soprattutto quando i campioni possono essere esposti direttamente all'ambiente.

1. Dato il requisito di assenza di microbiota, assicurarsi che il filtro e il tubo di gomma siano sterilizzati in autoclave per una sterilizzazione efficace. Assicurarsi che tutti gli altri materiali di consumo che potrebbero incontrare il terreno di coltura siano sterili e in confezioni sigillate. Eseguire il processo di rimozione dei detriti cellulari in una cappa a flusso laminare.
2. Assemblare la membrana di filtrazione da 0,45 μm e 0,22 μm all'apparato filtrante. Collegare una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali) e l'apparato filtrante con il tubo di gomma. Posizionare la membrana da 0,45 μm sopra la membrana da 0,22 μm; in caso contrario, potrebbe diminuire l'efficienza di filtrazione (Figura 1). Prestare attenzione a distinguere tra i lati anteriore e posteriore della membrana di microfiltrazione.
3. Avviare la pompa peristaltica per la filtrazione. Alimentato dalla pompa, il terreno basale delle cellule staminali mesenchimali (MSCBM) con un supplemento del 5% (vedi Tabella dei materiali) passa attraverso il filtro da un'estremità e il terreno di coltura filtrato può essere ottenuto all'altra estremità del filtro, come mostrato in (Figura 1). Raccogliere il terreno di coltura filtrato in una sacca di drenaggio con doppi canali. Mantenere l'integrità del sistema di filtrazione ottimizzando la velocità della pompa peristaltica e sostituendo la membrana filtrante secondo necessità.
4. Al termine della filtrazione, chiudere la valvola di ingresso sulla sacca di drenaggio e sigillarla ulteriormente con parafilm (vedere la Tabella dei materiali). Continuare con il passaggio successivo o conservare temporaneamente il terreno di coltura cellulare filtrato a 4 °C.

2. Concentrare il terreno di coltura filtrato con un emodializzatore

NOTA: Astenersi dall'utilizzare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente rosso fenolo in coltura cellulare, poiché il rilevatore di perdite di sangue nell'emodializzatore verrà attivato o spegnerà il rilevatore di perdite di sangue nell'impostazione dell'emodializzatore.

1. Preparare i materiali di consumo.
   1. Preparare le linee di sangue, le membrane in polisulfone ad alto flusso MWCO da 100 kDa, il dializzatore del sangue, il set per infusione, la soluzione salina fisiologica, la sacca per infusione, la soluzione di iodio e i tamponi di cotone prima della concentrazione (vedere la Tabella dei materiali).
2. Accensione del sistema e autotest.
   1. Controllare il collegamento del cavo di alimentazione dell'emodializzatore e accendere l'alimentazione principale.
   2. Attendere che la macchina completi l'intera procedura di autodiagnosi.
3. Installa le linee di sangue e il dializzatore.
   1. Verificare le date di scadenza delle linee di sangue monouso e del dializzatore, assicurandosi dell'integrità della loro confezione esterna e controllando eventuali danni alle linee.
   2. Installare il tubo nella stessa direzione del flusso sanguigno nel circuito extracorporeo, chiudendo in sequenza le valvole di derivazione per formare una circolazione a circuito chiuso.
4. Avviare la procedura di risciacquo.
   1. Utilizzare un set per infusione per collegare la soluzione salina fisiologica (senza eparina) da un tubo prima della pompa al circuito di dialisi. Collegare il sito di raccolta venosa alla sacca del fluido di scarto.
      NOTA: La soluzione fisiologica non deve contenere eparina o altri anticoagulanti.
   2. Collegare le linee di alimentazione/ritorno del dializzatore al dializzatore.
   3. Avviare l'emodializzatore e impostare la portata a 80-100 mL/min. Espellere tutta l'aria dal circuito di dialisi e dal dializzatore per garantire che l'intero sistema di tubi sia pieno di liquido.
   4. Regolare il piano del liquido nelle camere arteriosa e venosa a circa 2/3 di pieno. La soluzione salina scorre in sequenza attraverso la linea arteriosa, il dializzatore, la linea venosa e la sacca del liquido di scarto.
5. Avviare la concentrazione di ultrafiltrazione.
   1. Al termine della procedura di risciacquo, appendere la sacca di drenaggio contenente il terreno di coltura filtrato sul supporto per infusione, disinfettare il canale di uscita con tamponi di cotone imbevuti di iodio e collegare il canale di uscita della sacca di drenaggio a una porta pre-pompa utilizzando un set per infusione.
   2. Unisci la porta arteriosa e la porta venosa delle linee di sangue. Stabilire un circuito di dialisi di ultrafiltrazione isolato (ISO-UF, ultrafiltrazione senza flusso di dializzato) (Figura 1).
   3. Regolare il volume target di ultrafiltrazione sulla macchina per dialisi in modo che corrisponda al volume totale di liquido presente nella sacca di drenaggio. Impostare il tempo di dialisi dell'ultrafiltrazione sul tempo minimo di funzionamento del sistema. Dopo che i parametri sono stati impostati correttamente, avviare l'ultrafiltrazione.
      NOTA: A causa del calcolo del sistema di emodialisi, il tempo di dialisi non sarà troppo breve ma sarà mantenuto a una velocità più moderata.
6. Ottenere il fluido concentrato.
   1. Dopo aver raggiunto il volume di disidratazione target, chiudere il morsetto arterioso e collegare la porta venosa a una sacca per infusione sterile.
   2. Aprire la porta di pre-pompaggio delle linee ematiche monouso dotate di filtro dell'aria. Attivare la pompa del sangue a una velocità di circa 50 ml/min, consentendo al fluido all'interno delle linee sanguigne di circolare nuovamente dalla linea arteriosa alla linea venosa. Ritrarre tutto il fluido concentrato, circa 158 ml, dal circuito nella sacca sterile per infusione.
   3. Nella fase avanzata della concentrazione, raccogliere il liquido di scarto dalla linea di ritorno del dializzato. Applicare processi successivi identici a quelli del terreno di coltura concentrato al campione di fluido sprecato per monitorare eventuali perdite accidentali di sEV che potrebbero essersi verificate durante la concentrazione.
   4. Chiudere tutte le valvole e rimuovere la sacca per infusione, il dializzatore e tutte le linee. Spegnere l'alimentazione e disinfettare la macchina strofinandola.

3. Separazione delle sEV con ultracentrifuga

1. Trasferire il terreno di coltura concentrato in provette per ultracentrifuga e quindi bilanciarle.
2. Centrifugare in un'ultracentrifuga di grado clinico (vedi Tabella dei materiali) a 110.000 × g per 70 minuti, quindi lavare il pellet con soluzione salina sterile e procedere con una seconda centrifugazione a 110.000 × g per altri 70 minuti.
3. Risospendere le sEV pellettate in una quantità appropriata di soluzione salina sterile.
4. Trasferire le sEV in una provetta sterile per ulteriori test o conservarle a -80 °C per un uso futuro.

4. Caratterizzazione delle sEV ottenute

1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
   1. Diluire le sEV ottenute (1 μL) con PBS (1 mL) (vedi Tabella dei materiali). Regolare il numero di sEV visibili nel campo visivo corrente in modo che sia compreso tra 50 e 200.
   2. Iniettare con cura il campione diluito nel pozzetto del campione, evitando l'introduzione di bolle d'aria.
   3. Eseguire la misurazione quando il numero di particelle nel campo visivo è il più alto e stabile possibile per tutte le posizioni. I parametri di analisi sono i seguenti: Area massima: 1000, Area minima: 10, Luminosità minima: 30, Lunghezza traccia: 15, Temperatura: 25 °C, Sensibilità: 75.
   4. Misurare ogni campione almeno tre volte.
2. Analisi del Western blotting
   1. Soluzione diluita di sEVs in PBS. Utilizzare un kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico (BCA) (vedere la Tabella dei materiali) per misurare la concentrazione proteica.
   2. Far bollire i sEV nel tampone del campione a 100 °C per 5 minuti.
   3. Preparare un gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% (SDS-PAGE) (vedi Tabella dei materiali). Assemblare l'apparecchio per elettroforesi su gel. Caricare quantità uguali di proteine di ciascun campione nei pozzetti del gel SDS-PAGE. Impostare la tensione dell'elettroforesi a 80 V per la concentrazione e a 100 V per la separazione.
   4. Attivare la membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF) (vedere la Tabella dei materiali) con metanolo per 1 minuto, quindi immergere la membrana in PVDF nel tampone di trasferimento prima di procedere con il trasferimento a 100 V per 1 ora.
   5. Immergere la membrana PVDF in tampone TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) contenente il 5% di albumina sierica bovina (BSA; vedere Tabella dei materiali) e quindi bloccare per 30 minuti.
   6. Incubare la membrana in PVDF con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C su un agitatore. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: anti-CD63 umano (diluizione 1:1000), anti-CD9 umano (diluizione 1:1000) e anti-HSP70 umano (diluizione 1:1000) (vedi Tabella dei materiali).
   7. Il giorno successivo, lavare la membrana in PVDF con la soluzione di TBST cinque volte per 5 minuti ciascuna e quindi incubare con anticorpo secondario coniugato HRP (diluizione 1:10000) (vedere la Tabella dei materiali) a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
   8. Dopo aver lavato con TBST cinque volte, utilizzare un reagente di rilevamento della chemiluminescenza per l'imaging su un sistema a chemiluminescenza.
3. Microscopia elettronica a trasmissione
   1. Aggiungere una goccia di campione diluita con PBS da 20 μl a una carta oleata. Quindi, posizionare una griglia di rame (vedere Tabella dei materiali) sulla goccia in modo che la goccia del campione possa coprire la griglia di rame e lasciarla riposare a RT per 20 minuti.
   2. Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro. Quindi, fissare i campioni in una soluzione da 20 μL di paraformaldeide al 2%, glutaraldeide al 2% e una soluzione di fosfato 0,05 M per 2 minuti.
   3. Sciacquare la griglia di rame tre volte con acqua bidistillata, quindi colorare con 20 μL di acido fosfotungstico al 2% (PTA) per 1 minuto a RT.
   4. Assorbire il liquido ridondante con carta da filtro. Asciugare le griglie per una notte prima di essere analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Le impostazioni consigliate per TEM sono le seguenti: Esposizione: 1,0 s, Tensione HT 100,00 kV, Corrente del fascio: 50 μA, Dimensione spot: 1, Modalità: TEM. Queste impostazioni potrebbero cambiare seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).

Risultati

Caratterizzazione morfologica delle sEV
Nella fase finale della concentrazione, anche il fluido sprecato è stato raccolto come descritto. Il mezzo concentrato e il fluido di scarto sono stati ultracentrifugati, rispettivamente. Abbiamo raccolto le precipitazioni per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Come anticipato, un numero significativo di nanovescicole a forma di coppa è stato osservato nel gruppo del mez...

Discussione

I metodi tradizionali per l'isolamento delle sEV includono l'ultracentrifugazione differenziale, la cromatografia ad esclusione dimensionale e la precipitazione PEG, ciascuno con i propri pregi e demeriti. Sebbene l'amalgama di queste tecniche disparate possa migliorare la resa o la purezza delle sEV, passaggi aggiuntivi spesso introducono maggiori opportunità di contaminazione del campione. Sul mercato sono emersi sistemi integrati che dichiarano di estrarre sEV in massa e di aderire a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD63	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:1000 dilution
Anti-CD9	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:1000 dilution
Anti-HSP70	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit	Beyotime	P0012
Bloodlines	Fresenius Medical Care	AP16641
Bovine serum albumin 5%	Solarbio	9048-46-8
Cell culture supplement	Helios	HPCPLCGL05	5% (v/v) in cell culture media
Copper grid	Precise	RGRS GP-SMPG-1
Dialyzer	Helixone	FX8	100 kDa MWCO
Drainage bag	CZRUIDE	YLD-01
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)	Dakewe	DKW34-BM20500
Microfiltration membrane	shanghaixingya	WKLM-50-10	0.45 μm and 0.22 μm
Parafilm	Fisher Scientific	1337416
Peristaltic pump	LongerPump	YZ1515x
Phosphate buffer saline	Solarbio	P1022-500ml
Immun-Blot PVDF Membrane	BIO-RAD	1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0015A
Super ECL Plus Western Blotting Substrate	BIOGROUND	BG0001
TBST buffer	Solarbio	T1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman	344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	BIO-RAD
Hemodialyzer	NIKKISO	DBB-27
Nanoparticle Tracking Analysis	ZetaView	PMX120	To measure particle size distribution and particle concentration
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM-1400PLUS	Recommended settings?Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	OPTIMA XPN-100	SW 28Ti SwingingBucket Rotor