Isolement de petites vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses à partir d’échantillons de grand volume avec conformité aux BPF pour les essais cliniques

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses (MSC-sEVs) ont été mises en évidence comme une modalité de traitement acellulaire avec des effets indésirables minimes. Cette étude fournit un protocole combinant hémodialyse et ultracentrifugation, réduisant considérablement le temps consacré à l’ensemble du processus et garantissant le respect des normes de bonnes pratiques de fabrication (BPF).

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées de cellules souches mésenchymateuses (MSC-sEV) ont été mises en évidence comme une modalité de traitement sans cellules avec des effets indésirables minimes. En revanche, les méthodes d’extraction traditionnelles telles que l’ultracentrifugation et la chromatographie d’exclusion stérique sont limitées par leur intensité temporelle, leur coût et leur évolutivité. Pour pallier ces limitations, nous proposons une méthode intégrant un hémodialyseur et une ultracentrifugation. Cette approche utilise un appareil d’hémodialyse doté d’une membrane de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa, qui concentre sélectivement les sEV tout en filtrant une pléthore de protéines, améliorant ainsi le rendement et la pureté des sEV. Cette première étape de purification est suivie d’une ultracentrifugation pour affiner davantage la préparation du sEV. L’intégration de ces deux technologies a non seulement permis de réduire considérablement le temps consacré à l’ensemble du processus, mais aussi d’assurer le respect des normes de bonnes pratiques de fabrication (BPF). La méthode présente ici une grande efficacité pour isoler les sEV à partir d’un grand volume d’échantillons, offrant une avancée significative par rapport aux méthodes traditionnelles. Ce protocole est prometteur pour accélérer l’application des thérapies à base de VE dans la pratique clinique en fournissant une solution évolutive, rentable et conforme aux BPF.

Introduction

Les petites vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses (MSC-sEVs) sont des vésicules hétérogènes enrichies de multiples composants tels que l’ARNm, les micro-ARN, les cytokines, les lipides et les métabolites¹. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont souligné l’immense potentiel thérapeutique des MSC-sEV en tant que modalité de traitement acellulaire avec des effets indésirables minimes², ce qui est prometteur pour traiter un éventail de conditions, notamment le vieillissement, la dégénérescence tissulaire, le cancer et les troubles inflammatoires3,4,5,6. Néanmoins, l’extraction à grande échelle de sEV reste un défi critique, les méthodes traditionnelles s’avérant soit laborieusement chronophages, soit économiquement irréalisables. En outre, il est primordial d’assurer la reproductibilité pour l’application clinique et l’application des thérapies à base de VE⁷. Les chercheurs ont un besoin urgent d’une méthode de purification qui soit non seulement simple et efficace, mais aussi conforme aux normes de bonnes pratiques de fabrication (BPF)⁸.

Les méthodes de purification conventionnelles, y compris l’ultracentrifugation, l’ultrafiltration, la chromatographie d’exclusion stérique, l’immunoaffinité et la précipitation des polymères, ont été largement appliquées dans des recherches antérieures⁹. En général, les méthodes traditionnelles d’isolation sEV présentent des limites telles qu’un faible taux de rendement, une pureté compromise et des défis pour répondre à des normes aseptiques strictes. De plus, des recherches antérieures ont révélé le potentiel de techniques prometteuses telles que les systèmes microfluidiques^10,11, l’isolement magnétique sans marquage¹² et l’isolement par chimie covalente¹³ pour obtenir des performances exceptionnelles. Cependant, la nécessité de disposer d’équipements spécialisés rend ces techniques de pointe difficiles à adopter pour la majorité des équipes de recherche. En résumé, la méthode efficace permettant d’isoler les sEV de qualité GMP à partir d’un grand volume d’échantillons reste un obstacle critique, limitant les progrès de nombreuses équipes dans la recherche et les applications cliniques.

L’ultracentrifugation est la méthode la plus largement adoptée pour l’isolation des sEV et est reconnue comme la méthode de référence^14,15. Il s’agit d’une technique qui exploite les différences de densité et de taille pour isoler les sEV. Les sEV isolés sont généralement rincés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les contaminants résiduels. Ensuite, un volume approprié de PBS est généralement utilisé pour remettre en suspension les sEV rincés et différentes concentrations attendues de sEV peuvent être récoltées en contrôlant le volume de PBS. De plus, il est rapporté que la pureté des sEV plasmatiques obtenues par ultracentrifugation semble être meilleure que celle des sEV plasmatiques isolées par chromatographie d’exclusion stérique (SEC), et que les sEV obtenues par ultracentrifugation ont des impuretés de particules extracellulaires non vésiculaires (NVEP) plus faibles. Cela fait également de l’ultracentrifugation la plus largement utilisée et difficile à remplacer dans de nombreux traitements nécessitant de fortes concentrations de sEV. Cependant, en plus de la qualité et de la pureté, l’efficacité est également un facteur qui ne peut être ignoré dans l’extraction de sEV à grand volume. Jusqu’à présent, un seul cycle d’ultracentrifugation peut supporter un volume d’échantillon allant jusqu’à environ 600 ml, ce qui détermine qu’il est difficile de répondre à la demande d’extraction à grande échelle par la seule ultracentrifugation¹⁶.

Un appareil d’hémodialyse se compose d’un module à base de membrane qui abrite des milliers de fibres creuses. Le sang circule à travers ces fibres à l’intérieur d’une chambre cylindrique fermée¹⁷. Les constituants du sang peuvent passer sélectivement à travers ces membranes en fonction de leur taille moléculaire et de leur concentration ionique. En clinique, il est largement utilisé comme rein artificiel pour éliminer les déchets et les liquides en excès du sang des patients 18,19,20. En d’autres termes, l’hémodialyseur a également le potentiel de concentrer des échantillons de grand volume, en s’appuyant sur un processus similaire à la filtration à flux tangentiel (TFF). Dans les récentes directives publiées par la Société internationale des vésicules extracellulaires (ISEV), les concentrés de sEV sont considérés comme appropriés pour les échantillons de grand volume, tels que les milieux de culture cellulaire. Après des décennies de développement, les hémodialyseurs ont été largement adoptés dans les hôpitaux, soutenus par une abondance de consommables matures et un pool d’opérateurs qualifiés, ce qui facilite le maintien de la stérilité de l’échantillon.

Cette étude présente une méthode de purification des sEV basée sur un hémodialyseur et une ultracentrifugeuse compatible avec les GMP. Ici, nous choisissons des dialyseurs de 100 kDa de poids moléculaire coupé (MWCO), dont il a été démontré qu’ils capturent efficacement les sEV et filtrent de nombreuses protéines^22. L’ultracentrifugation constitue également une étape pour une purification ultérieure. Les travaux démontrent que l’hémodialyseur est tout aussi adapté à la concentration de sEV. Ce protocole permet aux chercheurs d’isoler efficacement les sEVs à partir d’échantillons de grand volume. Nous avons enregistré l’essai clinique dans le registre chinois des essais cliniques (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), qui est toujours en cours et n’est pas encore terminé. Bien que les données cliniques ne soient pas facilement disponibles pour la publication à l’heure actuelle, une méthode fiable, à grande échelle, efficace et conforme pour produire des sEV telles que rapportées dans ce protocole est une condition préalable à la réalisation d’essais précliniques et cliniques.

Protocole

Le protocole a été approuvé et mis en œuvre conformément au Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Hôpital du Sud-Ouest.

1. Élimination des débris cellulaires du milieu de culture

REMARQUE : Les procédures ci-dessous doivent être utilisées dans un environnement conforme aux BPF, en particulier lorsque les échantillons peuvent être directement exposés à l’environnement.

1. Étant donné l’exigence d’être exempt de microbiote, assurez-vous que le filtre et le tube en caoutchouc sont autoclavés pour une stérilisation efficace. Assurez-vous que tous les autres consommables susceptibles d’entrer en contact avec le milieu de culture sont stériles et emballés dans des emballages scellés. Effectuez le processus d’élimination des débris cellulaires dans une armoire à flux laminaire.
2. Assemblez les membranes de filtration de 0,45 μm et 0,22 μm à l’appareil de filtration. Connectez une pompe péristaltique (voir tableau des matériaux) et l’appareil de filtration avec le tube en caoutchouc. Positionnez la membrane de 0,45 μm au-dessus de la membrane de 0,22 μm ; sinon, cela peut diminuer l’efficacité de la filtration (Figure 1). Faites attention à faire la distinction entre les faces avant et arrière de la membrane de microfiltration.
3. Démarrer la pompe péristaltique pour la filtration. Alimenté par la pompe, le milieu basal de cellules souches mésenchymateuses (MSCBM) avec un supplément de 5 % (voir le tableau des matériaux) passe à travers le filtre à partir d’une extrémité, et le milieu de culture filtré peut être obtenu à l’autre extrémité du filtre, comme illustré (Figure 1). Rassembler le milieu de culture filtré dans un sac de drainage à deux canaux. Maintenir l’intégrité du système de filtration en optimisant la vitesse de la pompe péristaltique et en remplaçant la membrane de filtration au besoin.
4. Une fois la filtration terminée, fermez la soupape d’entrée du sac de drainage et scellez-la davantage avec du parafilm (voir tableau des matériaux). Passez à l’étape suivante ou stockez temporairement le milieu de culture cellulaire filtré à 4 °C.

2. Concentration du milieu de culture filtré à l’aide d’un hémodialyseur

REMARQUE : Évitez d’utiliser le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant du rouge de phénol en culture cellulaire, car le détecteur de fuite de sang dans l’hémodialyseur sera activé ou éteindrez le détecteur de fuite de sang dans le réglage de l’hémodialyseur.

1. Préparez les consommables.
   1. Préparez des lignées sanguines, des membranes en polysulfone à haut flux MWCO de 100 kDa, un dialyseur sanguin, un dispositif de perfusion, une solution saline physiologique, une poche de perfusion, une solution d’iode et des cotons-tiges avant la concentration (voir le tableau des matériaux).
2. Mettez le système sous tension et effectuez l’autotest.
   1. Vérifiez la connexion du câble d’alimentation de l’hémodialyseur et allumez l’alimentation principale.
   2. Attendez que l’appareil termine l’ensemble de la procédure d’autodiagnostic.
3. Installez les lignées et le dialyseur.
   1. Vérifiez les dates de péremption des lignées jetables et du dialyseur sanguin, en veillant à l’intégrité de leur emballage extérieur et en vérifiant qu’il n’y a pas de dommages aux lignes.
   2. Installez la tubulure dans le même sens que le flux sanguin dans le circuit extracorporel, en fermant séquentiellement les valves de dérivation pour former une circulation en boucle fermée.
4. Démarrez la procédure de rinçage.
   1. À l’aide d’un dispositif de perfusion, connectez la solution saline physiologique (sans héparine) d’un tube situé avant la pompe au circuit de dialyse. Raccordez le site de collecte veineuse au sac de déchets liquide.
      REMARQUE : La solution saline physiologique ne doit pas contenir d’héparine ou d’autres anticoagulants.
   2. Connectez les conduites d’alimentation/retour du dialysat au dialyseur.
   3. Démarrez l’hémodialyseur et réglez le débit à 80-100 mL/min. Expulsez tout l’air du circuit de dialyse et du dialyseur pour vous assurer que tout le système de tuyauterie est rempli de liquide.
   4. Ajustez le plan liquide dans les chambres artérielles et veineuses à environ 2/3 plein. La solution saline s’écoule séquentiellement à travers la ligne artérielle, le dialyseur, la ligne veineuse et le sac de liquide usé.
5. Démarrez la concentration d’ultrafiltration.
   1. Une fois la procédure de rinçage terminée, suspendez le sac de drainage contenant le milieu de culture filtré sur le support de perfusion, désinfectez le canal de sortie avec des cotons-tiges imbibés d’iode et connectez le canal de sortie du sac de drainage à un orifice de pré-pompe à l’aide d’un kit de perfusion.
   2. Joignez le port artériel et le port veineux des lignées. Etablir un circuit de dialyse d’ultrafiltration isolé (ISO-UF, ultrafiltration sans débit de dialysat) (Figure 1).
   3. Ajustez le volume cible d’ultrafiltration sur l’appareil de dialyse pour qu’il corresponde au volume total de liquide présent dans le sac de drainage. Réglez le temps de dialyse de l’ultrafiltration sur le temps de fonctionnement minimum du système. Une fois les paramètres réglés avec succès, lancez l’ultrafiltration.
      REMARQUE : En raison du calcul du système d’hémodialyse, le temps de dialyse ne sera pas trop court mais sera maintenu à un rythme plus modéré.
6. Obtenez le liquide concentré.
   1. Après avoir atteint le volume de déshydratation cible, fermez le clamp artériel et connectez l’orifice veineux à une poche de perfusion stérile.
   2. Ouvrez l’orifice de pré-pompe des conduites sanguines jetables équipées d’un filtre à air. Activez la pompe sanguine à une vitesse d’environ 50 mL/min, permettant au liquide dans les lignes sanguines de circuler à nouveau de la ligne artérielle à la ligne veineuse. Rétractez tout le liquide concentré, soit environ 158 ml, du circuit dans la poche de perfusion stérile.
   3. Au stade avancé de la concentration, récupérez le liquide gaspillé dans la conduite de retour du dialysat. Appliquer des procédés subséquents identiques à ceux du milieu de culture concentré à l’échantillon de fluide gaspillé afin de surveiller toute perte accidentelle de sEV qui aurait pu se produire pendant la concentration.
   4. Fermez toutes les vannes et retirez la poche de perfusion, le dialyseur et toutes les conduites. Coupez l’alimentation électrique et désinfectez la machine en l’essuyant.

3. Séparation des sEV avec ultracentrifugeuse

1. Transférez le milieu de culture concentré dans des tubes d’ultracentrifugation puis équilibrez-les.
2. Centrifuger dans une ultracentrifugeuse de qualité clinique (voir tableau des matériaux) à 110 000 × g pendant 70 min, puis laver la pastille avec une solution saline stérile et procéder à une deuxième centrifugation à 110 000 × g pendant 70 min supplémentaires.
3. Remettre en suspension les sEV granulés dans une quantité appropriée de solution saline stérile.
4. Transférez les sEV dans un tube stérile pour des tests supplémentaires ou stockez-les à -80 °C pour une utilisation future.

4. Caractérisation des sEVs obtenues

1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
   1. Diluer les sEVs obtenus (1 μL) avec du PBS (1 mL) (voir Tableau des matériaux). Ajustez le nombre de sEV visibles dans le champ de vision actuel pour qu’il soit compris entre 50 et 200.
   2. Injectez soigneusement l’échantillon dilué dans le puits de l’échantillon, en évitant l’introduction de bulles d’air.
   3. Effectuez la mesure lorsque le nombre de particules dans le champ de vision est aussi élevé et stable que possible pour toutes les positions. Les paramètres d’analyse sont les suivants : Surface maximale : 1000, Surface minimale : 10, Luminosité minimale : 30, Longueur de la trace : 15, Température : 25 °C, Sensibilité : 75.
   4. Mesurez chaque échantillon au moins trois fois.
2. Analyse par transfert Western
   1. Diluer la solution de sEVs dans du PBS. Utilisez un kit de dosage des protéines d’acide bicchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux) pour mesurer la concentration en protéines.
   2. Faites bouillir les sEV dans le tampon d’échantillon à 100 °C pendant 5 min.
   3. Préparez un gel d’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium à 12 % (voir le tableau des matériaux). Assemblez l’appareil d’électrophorèse sur gel. Chargez des quantités égales de protéines de chaque échantillon dans les puits de gel SDS-PAGE. Réglez la tension d’électrophorèse à 80 V pour la concentration et à 100 V pour la séparation.
   4. Activer la membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir Tableau des matériaux) avec du méthanol pendant 1 min, puis tremper la membrane PVDF dans un tampon de transfert avant de procéder au transfert à 100 V pendant 1 h.
   5. Immerger la membrane PVDF dans un tampon TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl et 0,1 % Tween 20) contenant 5 % d’albumine sérique bovine (BSA ; voir tableau des matériaux) puis bloquer pendant 30 min.
   6. Incuber la membrane PVDF avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur. Les principaux anticorps utilisés sont les suivants : anti-CD63 humain (dilution 1:1000), anti-CD9 humain (dilution 1:1000) et anti-HSP70 humain (dilution 1:1000) (voir le tableau des matériaux).
   7. Le lendemain, laver la membrane PVDF avec une solution de TBST cinq fois pendant 5 min chacune, puis incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (dilution 1:10000) (voir tableau des matériaux) à température ambiante (RT) pendant 1 h.
   8. Après avoir lavé avec TBST cinq fois, utilisez un réactif de détection de chimiluminescence pour l’imagerie sur un système de chimiluminescence.
3. Microscopie électronique à transmission
   1. Ajoutez une goutte d’échantillon diluée de 20 μL de PBS à un papier ciré. Ensuite, placez une grille de cuivre (voir le tableau des matériaux) sur la goutte afin que la goutte d’échantillon puisse couvrir la grille de cuivre et laissez-la reposer à RT pendant 20 min.
   2. Absorbez l’excès de liquide avec du papier filtre. Ensuite, fixez les échantillons dans une solution de 20 μL de paraformaldéhyde à 2 %, de glutaraldéhyde à 2 % et de solution de phosphate à 0,05 M pendant 2 min.
   3. Rincez trois fois la grille de cuivre avec de l’eau bi-distillée, puis colorez avec 20 μL d’acide phosphotungstique (PTA) à 2 % pendant 1 min à RT.
   4. Absorbez le liquide redondant avec du papier filtre. Sécher les grilles pendant la nuit avant d’être analysées par microscopie électronique à transmission (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les paramètres recommandés pour le TEM sont les suivants : Exposition : 1.0 s, Tension HT 100.00 kV, Courant de faisceau : 50 μA, Taille du spot : 1, Mode : TEM. Ces paramètres peuvent changer selon les instructions du fabricant (voir la table des matériaux).

Résultats

Caractérisation morphologique des sEVs
Dans la dernière étape de la concentration, le fluide gaspillé a également été collecté comme décrit. Le fluide concentré et le fluide gaspillé ont été respectivement ultracentrifugés. Nous avons recueilli les précipitations pour l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET). Comme prévu, un nombre important de nanovésicules en forme de coupe ont été observées ...

Discussion

Les méthodes traditionnelles d’isolement des sEV comprennent l’ultracentrifugation différentielle, la chromatographie d’exclusion stérique et la précipitation PEG, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. Bien que la fusion de ces techniques disparates puisse améliorer le rendement ou la pureté des sEV, des étapes supplémentaires introduisent souvent plus de possibilités de contamination des échantillons. Il existe sur le marché des systèmes intégrés pr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD63	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:1000 dilution
Anti-CD9	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:1000 dilution
Anti-HSP70	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit	Beyotime	P0012
Bloodlines	Fresenius Medical Care	AP16641
Bovine serum albumin 5%	Solarbio	9048-46-8
Cell culture supplement	Helios	HPCPLCGL05	5% (v/v) in cell culture media
Copper grid	Precise	RGRS GP-SMPG-1
Dialyzer	Helixone	FX8	100 kDa MWCO
Drainage bag	CZRUIDE	YLD-01
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD63A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	1:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRP	SBI System Biosciences	EXOAB-Hsp70A-1	1:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)	Dakewe	DKW34-BM20500
Microfiltration membrane	shanghaixingya	WKLM-50-10	0.45 μm and 0.22 μm
Parafilm	Fisher Scientific	1337416
Peristaltic pump	LongerPump	YZ1515x
Phosphate buffer saline	Solarbio	P1022-500ml
Immun-Blot PVDF Membrane	BIO-RAD	1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0015A
Super ECL Plus Western Blotting Substrate	BIOGROUND	BG0001
TBST buffer	Solarbio	T1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL	Beckman	344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	BIO-RAD
Hemodialyzer	NIKKISO	DBB-27
Nanoparticle Tracking Analysis	ZetaView	PMX120	To measure particle size distribution and particle concentration
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM-1400PLUS	Recommended settings?Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	OPTIMA XPN-100	SW 28Ti SwingingBucket Rotor