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요약

중간엽 줄기세포(MSC-sEV)에서 유래한 작은 세포외 소포체는 부작용을 최소화하는 무세포 치료 방식으로 강조되어 왔습니다. 이 연구는 혈액 투석과 초원심분리를 결합한 프로토콜을 제공하여 전체 프로세스에 소요되는 시간을 크게 줄이고 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준을 준수하도록 합니다.

초록

중간엽 줄기세포(MSC-sEV)에서 유래한 작은 세포외 소포체(sEV)는 부작용을 최소화하는 무세포 치료 방식으로 강조되어 왔습니다. 반면, 초원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 기존 추출 방법은 시간 강도, 비용 및 확장성으로 인해 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 혈액 투석기와 초원심분리를 통합하는 방법을 제안합니다. 이 접근 방식은 100kDa 분자량 컷오프(MWCO) 멤브레인이 있는 혈액 투석 장치를 사용하여 과다한 단백질을 걸러내면서 sEV를 선택적으로 농축하여 sEV의 수율과 순도를 향상시킵니다. 이 초기 정제 단계 후에는 sEV 제제를 더욱 정제하기 위한 초원심분리가 이어집니다. 이 두 기술의 통합으로 전체 프로세스에 소요되는 시간이 크게 단축되었을 뿐만 아니라 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준을 준수할 수 있었습니다. 여기서의 방법은 많은 양의 샘플에서 sEV를 분리하는 데 높은 효율성을 보여주며 기존 방법보다 상당한 발전을 제공합니다. 이 프로토콜은 확장 가능하고 비용 효율적이며 GMP를 준수하는 솔루션을 제공함으로써 EV 기반 치료법을 임상 실습으로 전환하는 것을 가속화할 수 있는 가능성을 제공합니다.

서문

중간엽 줄기세포(MSC-sEV)에서 유래한 작은 세포외 소포체는 mRNA, 마이크로 RNA, 사이토카인, 지질 및 대사 산물과 같은 여러 성분이 풍부한 이종 소포입니다1. 최근 몇 년 동안 많은 연구에서 부작용을 최소화한 무세포 치료 방식으로서 MSC-sEV의 엄청난 치료 잠재력이 강조되었으며2 노화, 조직 변성, 암 및 염증성 장애를 포함한 다양한 질환을 치료할 수 있는 가능성을 보여주었습니다 3,4,5,6. 그럼에도 불구하고 sEV의 대규모 추출에는 중요한 과제가 남아 있으며, 기존 방법은 힘들게 시간이 많이 걸리거나 경제적으로 실현 불가능한 것으로 입증되었습니다. 또한, EV 기반 치료법의 임상 적용 및 번역을 위해서는 재현성을 보장하는 것이 가장 중요합니다7. 연구자들은 간단하고 효율적일 뿐만 아니라 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준8을 준수하는 정제 방법이 절실히 필요합니다.

초원심분리(ultracentrifugation), 한외여과(ultrafiltration), 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography), 면역친화성(immunoaffinity), 폴리머 침전(polymer precipitation)을 포함한 기존의 정제 방법은 이전 연구에서 광범위하게 적용되었습니다9. 일반적으로 sEV 분리를 위한 기존 방법은 낮은 수율, 순도 저하, 엄격한 무균 표준 충족 등의 한계가 있습니다. 또한, 이전 연구에서는 뛰어난 성능을 달성하기 위해 미세유체 시스템10,11, 무표지 자기 절연12 및 공유 화학 절연13과 같은 유망한 기술의 잠재력을 보고했습니다. 그러나 특수 장비에 대한 요구 사항으로 인해 대부분의 연구 팀이 이러한 고급 기술을 채택하기가 어렵습니다. 요약하면, 많은 양의 샘플에서 GMP 등급 sEV를 분리하는 효율적인 방법은 여전히 중요한 장애물로 남아 있어 연구 및 임상 응용 분야에서 수많은 팀의 진행을 제한합니다.

초원심분리는 sEV 분리에 가장 널리 채택되는 방법이며 황금 표준 방법으로 인식되고 있습니다14,15. 밀도와 크기의 차이를 활용하여 sEV를 분리하는 기술입니다. 분리된 sEV는 일반적으로 잔류 오염 물질을 제거하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다. 그런 다음, 일반적으로 헹굼된 sEV를 재현탁하기 위해 적절한 부피의 PBS를 사용하고, PBS의 부피를 조절하여 다양한 예상 농도의 sEV를 수확할 수 있습니다. 또한, 초원심분리에 의해 얻어진 플라즈마 sEV의 순도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리된 플라즈마 sEV보다 우수한 것으로 나타나며, 초원심분리에 의해 얻어진 sEV는 비소포성 세포외 입자(NVEP) 불순물이 더 낮은 것으로 보고되었습니다. 이것은 또한 초원심분리를 가장 널리 사용되며 고농도의 sEV가 필요한 많은 치료에서 대체하기 어렵게 만듭니다. 그러나 품질과 순도 외에도 효율성은 대량 sEV 추출에서 무시할 수 없는 요소입니다. 지금까지 한 차례의 초원심분리로 최대 약 600mL의 시료를 지원할 수 있으며, 이는 초원심분리16만으로는 대규모 추출에 대한 수요를 충족하기 어렵다고 판단되었습니다.

혈액 투석 장치는 수천 개의 중공 섬유를 수용하는 멤브레인 기반 모듈로 구성됩니다. 혈액은 밀폐된 원통형 챔버17 내에서 이러한 섬유를 통해 순환합니다. 혈액의 구성 성분은 분자 크기와 이온 농도에 따라 이러한 막을 선택적으로 통과할 수 있습니다. 임상에서는 환자의 혈액에서 노폐물과 과도한 체액을 제거하는 인공 신장으로 널리 사용됩니다 18,19,20. 즉, 혈액 투석기는 접선 유동 여과(TFF)와 유사한 공정에 의존하여 대량의 시료를 농축할 수 있는 잠재력도 가지고 있습니다. ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)에서 발행한 최근 가이드라인에 따르면 sEV 농축액은 세포 배양 배지와 같은 대용량 샘플에 적합한 것으로 간주됩니다. 수십 년에 걸친 개발 끝에 혈액 투석기는 병원에서 널리 채택되었으며, 풍부한 성숙한 소모품과 숙련된 작업자 풀의 지원을 받아 샘플을 더 쉽게 멸균 상태로 유지할 수 있습니다.

본 연구는 GMP와 호환되는 혈액투석기 및 초원심분리기를 기반으로 하는 sEV 정제 방법을 제시합니다. 여기에서는 100kDa 분자량 한계치(MWCO)의 투석기를 선택하며, 이는 sEV를 효과적으로 포획하고 수많은 단백질을 걸러내는 것으로 입증되었습니다22. 초원심분리는 또한 추가 정제를 위한 단계를 제공합니다. 이 연구는 혈액 투석기가 sEV의 집중에 동등하게 적합하다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 통해 연구원은 대용량 샘플에서 sEV를 효율적으로 분리할 수 있습니다. 중국 임상시험 등록부(Chinese Clinical Trial Registry, ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018)에 임상시험을 등록했으며, 아직 진행 중이며 아직 완료되지 않았습니다. 현재로서는 임상 데이터를 쉽게 발표할 수 없지만, 이 프로토콜에 보고된 바와 같이 sEV를 생산하기 위한 신뢰할 수 있고, 대규모이며, 효율적이고, 규정을 준수하는 방법은 전임상 및 임상 시험을 수행하기 위한 전제 조건입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Southwest Hospital의 인간 연구 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee)에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1. 배양 배지에서 세포 파편을 제거하는 단계

참고: 아래 절차는 특히 샘플이 환경에 직접 노출될 수 있는 경우 GMP 준수 환경에서 작동해야 합니다.

  1. 미생물총(microbiota-free)이라는 요구 사항을 감안할 때, 효과적인 멸균을 위해 필터와 고무 튜브를 고압멸균해야 합니다. 배양 배지와 접촉할 수 있는 다른 모든 소모품이 멸균 상태이며 밀봉된 포장에 들어 있는지 확인합니다. 층류 캐비닛에서 세포 파편을 제거하는 과정을 수행합니다.
  2. 0.45μm 및 0.22μm 여과막을 필터 장치에 조립합니다. 연동 펌프( 재료 표 참조)와 필터 장치를 고무 튜브에 연결합니다. 0.45μm 멤브레인을 0.22μm 멤브레인 위에 배치합니다. 그렇지 않으면 필트레이션 효율이 저하될 수 있습니다(그림 1). 미세 여과막의 앞면과 뒷면을 구별하는 데 주의하십시오.
  3. 여과를 위한 연동 펌프를 시작합니다. 펌프에 의해 구동되는 5% 보충제( 표 참조)가 포함된 중간엽 줄기 세포 기저 배지(MSCBM)는 한쪽 끝에서 필터를 통과하며, 여과된 배양 배지는 (그림 1)과 같이 필터의 다른 쪽 끝에서 얻을 수 있습니다. 여과된 배양 배지를 이중 채널이 있는 배수 백에 모읍니다. 연동 펌프 속도를 최적화하고 필요에 따라 여과막을 교체하여 여과 시스템의 무결성을 유지합니다.
  4. 여과가 완료되면 배수 백의 흡입 밸브를 닫고 파라필름으로 추가로 밀봉합니다(재료 표 참조). 다음 단계를 계속하거나 여과된 세포 배양 배지를 4°C에서 임시로 보관합니다.

2. 여과된 배양 배지를 혈액투석기로 농축

참고: 혈액 투석기의 혈액 누출 감지기가 활성화되거나 혈액 투석 설정에서 혈액 누출 감지기가 종료되므로 세포 배양에서 페놀이 빨간색을 함유한 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 사용을 자제하십시오.

  1. 소모품을 준비합니다.
    1. 농축 전에 혈관, 100kDa MWCO 고유량 폴리설폰 멤브레인, 혈액 투석기, 주입 세트, 생리식염수, 주입 백, 요오드 용액 및 면봉을 준비합니다( 재료 표 참조).
  2. 시스템 전원을 켜고 자체 테스트합니다.
    1. 혈액 투석 전원 케이블의 연결을 확인하고 주 전원을 켜십시오.
    2. 기계가 전체 자가 진단 절차를 완료할 때까지 기다립니다.
  3. 혈통과 투석기를 설치하십시오.
    1. 일회용 혈통과 혈액 투석기의 유통 기한을 확인하고 외부 포장의 무결성을 확인하고 라인에 손상이 있는지 확인합니다.
    2. 체외 회로의 혈류와 같은 방향으로 튜브를 설치하고 분기 밸브를 순차적으로 닫아 폐쇄 루프 순환을 형성합니다.
  4. 헹굼 절차를 시작합니다.
    1. 주입 세트를 사용하여 펌프 전 튜브의 생리식염수(헤파린 제외)를 투석 회로에 연결합니다. 정맥 수집 장소를 폐액 백에 연결합니다.
      참고: 생리적 식염수에는 헤파린이나 기타 항응고제가 포함되어서는 안 됩니다.
    2. 투석액 공급/회수 라인을 투석기에 연결합니다.
    3. 혈액 투석기를 시작하고 유속을 80-100mL/분으로 설정합니다. 투석 회로와 투석기에서 모든 공기를 배출하여 전체 튜빙 시스템이 액체로 채워지도록 합니다.
    4. 동맥 및 정맥실의 액체 평면을 약 2/3로 조정합니다. 식염수는 동맥관, 투석기, 정맥관 및 폐액 주머니를 통해 순차적으로 흐릅니다.
  5. 한외여과 농도를 시작합니다.
    1. 헹굼 절차를 마친 후 여과된 배양 배지가 들어 있는 배액 백을 주입 스탠드에 걸고 요오드에 적신 면봉으로 출력 채널을 소독하고 주입 세트를 사용하여 배액 백의 출력 채널을 사전 펌프 포트에 연결합니다.
    2. 혈통의 동맥 항구와 정맥 항구에 합류하십시오. 분리된 한외여과(ISO-UF, 투석액 흐름이 없는 한외여과) 투석 회로를 설정합니다(그림 1).
    3. 투석기의 한외여과 목표 부피를 배수 백에 존재하는 총 유체 부피와 일치하도록 조정합니다. 한외여과의 투석 시간을 시스템의 최소 작동 시간으로 설정합니다. 매개변수가 성공적으로 설정되면 한외여과를 시작합니다.
      참고: 혈액 투석 시스템의 계산으로 인해 투석 시간은 너무 짧지 않고 보다 적당한 속도로 유지됩니다.
  6. 농축 유체를 얻습니다.
    1. 목표 탈수량에 도달한 후 동맥 클램프를 닫고 정맥 포트를 멸균 주입 백에 연결합니다.
    2. 에어 필터가 장착된 일회용 혈액 라인의 사전 펌프 포트를 엽니다. 약 50mL/분의 속도로 혈액 펌프를 작동시켜 혈관 내의 액체가 동맥선에서 정맥관으로 다시 순환할 수 있도록 합니다. 회로에서 약 158mL의 모든 농축 유체를 멸균 주입 백으로 다시 집어넣습니다.
    3. 집중의 후반 단계에서는 투석액 회수 라인에서 낭비되는 액체를 수집합니다. 농축된 배양 배지와 동일한 후속 프로세스를 낭비된 유체 샘플에 적용하여 농축 중에 발생할 수 있는 sEV의 우발적인 손실을 모니터링합니다.
    4. 모든 밸브를 닫고 주입 백, 투석기 및 모든 라인을 제거합니다. 전원을 끄고 기기를 닦아 소독하십시오.

3. 초원심분리기로 sEV 분리

  1. 농축된 배양 배지를 초원심분리기 튜브로 옮긴 다음 균형을 맞춥니다.
  2. 임상 등급 초원심분리기( 재료 표 참조)에서 110,000 ×g에서 70 분 동안 원 심분리기를 한 다음 펠릿을 멸균 식염수로 세척하고 110,000 × g 에서 다시 70분 동안 두 번째 원심분리를 진행합니다.
  3. 펠릿화된 sEV를 적절한 양의 멸균 식염수에 재현탁합니다.
  4. 추가 테스트를 위해 sEV를 멸균 튜브로 옮기거나 나중에 사용할 수 있도록 -80°C에서 보관하십시오.

4. 획득된 sEV의 특성화

  1. 나노 입자 추적 분석(NTA)
    1. 얻어진 sEV(1μL)를 PBS(1mL)로 희석합니다( 재료표 참조). 현재 시야에 표시되는 sEV의 수를 50에서 200 사이로 조정합니다.
    2. 희석된 샘플을 샘플 웰에 조심스럽게 주입하여 기포가 유입되지 않도록 합니다.
    3. 시야의 입자 수가 모든 위치에서 가능한 한 높고 안정적일 때 측정을 수행합니다. 분석 매개 변수는 다음과 같습니다 : 최대 영역 : 1000, 최소 영역 : 10, 최소 밝기 : 30, 추적 길이 : 15, 온도 : 25 ° C, 감도 : 75.
    4. 각 샘플을 최소 3회 측정합니다.
  2. 웨스턴 블로팅 분석
    1. PBS에서 sEV 용액을 희석합니다. Bicinchoninic Acid (BCA) 단백질 분석 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
    2. 샘플 버퍼의 sEV를 100°C에서 5분 동안 끓입니다.
    3. 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔을 준비합니다( 재료표 참조). 겔 전기영동 장치를 조립합니다. 각 샘플의 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 젤 웰에 로드합니다. 전기 영동 전압을 농도의 경우 80V, 분리의 경우 100V로 설정합니다.
    4. 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(재료 표 참조)을 메탄올로 1분 동안 활성화한 다음 PVDF 멤브레인을 전사 버퍼에 담근 후 100V에서 1시간 동안 전사를 진행합니다.
    5. PVDF 멤브레인을 5% 소 혈청 알부민(BSA, 재료 표 참조)이 포함된 TBST 완충액(20mM Tris, 150mM NaCl 및 0.1% Tween 20)에 담근 다음 30분 동안 차단합니다.
    6. 쉐이커에서 4°C에서 하룻밤 동안 PVDF 멤브레인을 1차 항체와 함께 배양합니다. 사용되는 주요 항체는 human anti-CD63 (1:1000 희석), human anti-CD9 (1:1000 희석), human anti-HSP70 (1:1000 희석)입니다( Table of Materials 참조).
    7. 다음날, PVDF 멤브레인을 TBST 용액으로 각각 5분씩 5회 세척한 후 실온(RT)에서 1시간 동안 HRP 접합 2차 항체(1:10000 희석)( 재료 표 참조)로 배양합니다.
    8. TBST로 5회 세척한 후 화학발광 시스템에서 이미징하기 위해 화학발광 검출 시약을 사용합니다.
  3. 투과 전자 현미경
    1. 20μL PBS로 희석된 샘플 드롭을 왁스 종이에 떨어뜨립니다. 그런 다음 구리 그리드( 재료 표 참조)를 드롭에 놓아 샘플 드롭이 구리 그리드를 덮고 20분 동안 실온을 유지할 수 있도록 합니다.
    2. 여과지로 과도한 액체를 흡수하십시오. 그런 다음 2% 파라포름알데히드, 2% 글루타르알데히드 및 0.05M 인산염 용액의 20μL 용액에 샘플을 2분 동안 고정합니다.
    3. 구리 그리드를 이중 증류수로 세 번 헹군 다음 RT에서 1분 동안 20μL의 2% 포스포텅스텐산(PTA)으로 염색합니다.
    4. 여과지로 여분의 액체를 흡수합니다. 투과 전자 현미경으로 분석하기 전에 그리드를 밤새 건조시킵니다( 재료 표 참조).
      참고: TEM에 대한 권장 설정은 다음과 같습니다: 노출: 1.0초, HT 볼륨tage 100.00kV, 빔 전류: 50μA, 스폿 크기: 1, 모드: TEM. 이러한 설정은 제조업체의 지침에 따라 변경될 수 있습니다( 재료 표 참조).

결과

sEV의 형태학적 특성화
농축의 마지막 단계에서 낭비되는 유체도 설명된 대로 수집되었습니다. 농축된 매체와 폐기된 유체를 각각 초원심분리했습니다. 투과전자현미경(TEM) 분석을 위한 강수량을 수집했습니다. 예상한 바와 같이, 농축된 배지 그룹에서 상당한 수의 컵 모양의 나노소포가 관찰되었습니다(그림 2A

토론

sEV를 분리하는 전통적인 방법에는 차등 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피 및 PEG 침전이 포함되며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. 이러한 이질적인 기술을 통합하면 sEV의 수율 또는 순도를 향상시킬 수 있지만, 추가 단계를 통해 시료 오염이 발생할 수 있는 더 많은 기회가 발생하는 경우가 많습니다. sEV를 대량으로 추출하고 GMP 표준을 준수한다고 주장하는 통...

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립과학재단(822101167, BB로), 충칭 자연과학재단(CSTB2022NSCQ-MSX0020에서 BB), 충칭 박사 "Through Train" 과학 연구 프로젝트(CSTB2022BSXM-JCX0031에서 BB) 및 중국 국립과학재단(82271132에서 YL)의 자금 지원을 받았습니다. 장비 및 기술 지원에 대한 신장내과, 제1부속병원, 제3군의과대학(육군 의과대학), 병리학 연구소 및 남서부 암 센터, 남서부 병원, 제3 군사 의과대학(육군 의과대학)의 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 dilution
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 dilution
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 dilution
Bicinchoninic Acid Protein Assay KitBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CareAP16641
Bovine serum albumin 5%Solarbio9048-46-8
Cell culture supplementHeliosHPCPLCGL055% (v/v) in cell culture media
Copper gridPreciseRGRS GP-SMPG-1
DialyzerHelixoneFX8100 kDa MWCO
Drainage bagCZRUIDEYLD-01
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 dilution
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 dilution
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Microfiltration membraneshanghaixingyaWKLM-50-100.45 μm and 0.22 μm 
ParafilmFisher Scientific1337416
Peristaltic pumpLongerPumpYZ1515x
Phosphate buffer salineSolarbioP1022-500ml
Immun-Blot PVDF MembraneBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
TBST bufferSolarbioT1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mLBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Nanoparticle Tracking AnalysisZetaViewPMX120To measure particle size
distribution and particle
concentration
Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM-1400PLUSRecommended settings：Exposure: 1.0 s, HT Voltafe 100.00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti SwingingBucket Rotor

참고문헌

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