PBMC的人CD40激活的B细胞产生的协议分为两部分：A部分演示NIH/3T3细胞，将用于板约束的饲养层细胞表达CD40配体的准备。 B部分介绍了各种实际的CD40 - B的文化。 A.制备饲养细胞（N​​IH/3T3 tCD40L） tCD40L NIH/3T3壁小鼠成纤维细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。 <ol><li>从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。 </li><li>添加4 mL的胰蛋白酶/ EDTA在75厘米的 2瓶5-10分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。 </li><li>野生型中添加10毫升，并轻轻旋转。 </li><li>转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转5分钟在225 XG细胞。 </li><li>去除上清，重悬沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管： <ol><li> 1.5 × 10 6细胞传代</li><li> 0.2 × 10 6细胞/孔的CD40 - B细胞培养用于照射</li><li>其余冻结（如需要）。 </li></ol></li><li>旋转细胞在225 5分钟XG。 </li><li>去除上清。 <ol><li>传代培养：重悬于1.5 × 10 6细胞10毫升，75厘米2细胞培养瓶中的野生型中（细胞密度为1.5 × 10 5细胞/ mL），加入的G - 418 [0.7毫克/毫升]和孵化细胞37℃，5％的CO 2 。每周两次分裂的细胞。 </li><li>对于CD40 - B细胞培养：您需要1.2 × 10 6 6孔板细胞。在野生型中重悬的细胞密度0.1 × 10 6细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tCD40L NIH/3T3细胞是贴壁时（至少4个小时：坚持用显微镜检查;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B） </li></ol></li></ol> B. CD 40 - B细胞培养一，制备外周血CD40的刺激（0天）： 请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法白细胞介素4和环孢素A培养基中，使用前。 <ol><li>取外周血，新鲜或适当解冻。悬浮外周血1X PBS毫升，两次把它们洗干净，和自旋向下第一时间为7分钟，第二次在7分钟190 XG删除其他细胞在265 XG。弃上清，并在20毫升的PBS重悬细胞。确定细胞的细胞悬液分装数。 </li><li>离心5分钟在225 XG所需的细胞量。对于6孔板4 × 10 6细胞/孔的需要，因此24 × 10 6细胞每盘。 </li><li>去除上清，重悬CD40 - B的文化与50 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的外周血单个核细胞在1 × 10 6细胞/ mL，作为一种生长因子和0.63微克/毫升环孢素A到防止T细胞的产物（给定的浓度是指一毫升培养液）。 </li><li>去除上清从6孔板前培养与tCD40L NIH/3T3细胞。 </li><li>每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质，清洗附着tCD40L NIH/3T3细胞。 </li><li>轻轻添加4毫升的外周血单个核细胞悬液（1 × 10 6细胞/ mL），每孔6孔板。 </li><li>细胞在37 ° C的5％的CO 2。 </li><li>第7天，reculture细胞（3.2继续。） </li></ol>二。复垦的CD40的B细胞（7天，然后每隔3-4天）： <ol><li>从6孔板CD40 - B细胞10毫升到50毫升管的移液器和池他们resuspending收获集群。 </li><li>离心7分钟在225 XG，并完全取代CD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，5分钟旋转225 XG细胞。悬浮CD40的B细胞CD40 - B的培养基中，在浓度为1 × 10 6细胞/ mL 。 </li><li>在50 U / mL的浓度和0.63μg/ mL的环孢素A的中期添加新鲜的白细胞介素4的解决方案。 </li><li>从6孔板与tCD40L NIH/3T3细胞预孵育取出上清。 </li><li>每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质清洗贴壁细胞。 </li><l我&gt;轻轻每6孔板以及添加4毫升（1 × 10 6细胞/ ml）CD40 - B的悬挂。 </li><li>孵育板在37℃，5％的CO 2。 </li><li>再次传代培养细胞每隔3-4天，结束与高纯度的人CD40 B细胞激活后，共14天。 </li></ol> C.故障排除 - CD40 - B细胞，如果不增长？ <ol><li>你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？ </li><li>板势必给料机，用于刺激细胞不应超过24h以上吗？ </li><li>支原体可能是一个污染？ </li><li>白细胞介素4的解决方案，为补充新鲜解冻，并有适当的生物活性？ </li><li>环孢素A中添加正确的浓度？ </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="图1" /> 图1，请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">点击这里</a>为图1的放大版本。 <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="图2" /> 图2，请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">点击这里</a>为图2的较大版本。

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	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li><li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma.">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li></ol>

A.媒体的制备： <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 直属细胞野生型中 </td><td colspan="2"> 馈线小区选择培养基 </td></tr><tr><td> 试剂 </td><td> 集中 </td><td> 试剂 </td><td> 集中 </td></tr><tr><td> DMEM - HAM / F12 </td><td></td><td> DMEM - HAM / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L -谷氨酰胺</td><td> 365微克/毫升</td><td> L -谷氨酰胺</td><td> 365微克/毫升</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10毫米</td><td> HEPES </td><td> 10毫米</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td></tr><tr><td></td><td></td><td> G - 418 </td><td> 0.7毫克/毫升</td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40 - B的清洗介质 </td><td colspan="2"> CD40 - B的培养基 </td></tr><tr><td> 试剂 </td><td> 集中 </td><td> 试剂 </td><td> 集中 </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L -谷氨酰胺</td><td> 584微克/毫升</td><td> L -谷氨酰胺</td><td> 584微克/毫升</td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25毫米</td><td> HEPES </td><td> 25毫米</td></tr></tbody><tbody><tr><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td><td>庆大霉素</td><td> 15微克/毫升</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH转</td><td> 50微克/毫升</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH胰岛素</td><td> 5微克/毫升</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB - Humanserum </td><td> 10％ </td></tr></tbody></table> B.其它试剂： <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 试剂 </td><td> 公司 </td><td> 订单号 </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / HAM的F12 </td><td>临时机场管理局</td><td>猫编号：E15 - 813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen公司Gibco公司® </td><td>楼盘21980-032 </td></tr><tr><td>贝科的PBS（10X） </td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有H15 - 011 </td></tr><tr><td> AB人血清</td><td> Invitrogen公司</td><td> CAT无34005100 </td></tr><tr><td>全息转人类</td><td>西格玛</td><td> CAT没有T0665 </td></tr><tr><td>胰岛素人类</td><td>西格玛</td><td> CAT没有I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td>三角洲选择</td><td>货号7395800 </td></tr><tr><td>重组人白细胞介素- 4 </td><td> Immunotools </td><td> CAT无11130045 </td></tr><tr><td>环孢素A </td><td>诺华公司</td><td>猫没有NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>龙沙</td><td>猫没有DE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPES缓冲液</td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有S11 - 001 </td></tr><tr><td> G - 418硫酸盐</td><td>临时机场管理局</td><td>猫没有P02 - 012 </td></tr><tr><td>胰蛋白酶/ EDTA（10X） </td><td> Invitrogen公司Gibco公司® </td><td>楼盘15400-054 </td></tr></tbody></table> C.杂项用品： <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 试剂 </td><td> 公司 </td><td> 订单号 </td></tr><tr></tr><tr><td>无菌移液器</td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6孔板</td><td> NUNC </td><td> CAT没有140675 </td></tr><tr><td> 50毫升锥形管</td><td> BD猎鹰™ </td><td> CAT没有352070 </td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td> SARSTEDT </td><td> CAT没有83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generation of human cd40-activated b cells

CD40激活的B细胞（CD40 - B细胞）已被确定为肿瘤免疫治疗的免疫刺激抗原提呈细胞（APC）1-3的替代来源。树突状细胞（DCs），最好的APC，CD40 - B细胞有几个不同的生物和技术性能相比。与区议会，B细胞的MHC和共刺激分子（图1b）的表达增加，表现出强烈的的迁徙能力和目前的T细胞抗原提呈效率，刺激白细胞介素4和CD40配体（CD40L）。然而，在不成熟或成熟的DCS相比，CD40 - B细胞表达完整的淋巴结归巢CD62L，CCR7/CXCR4组成的黑社会，和白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），归巢到次级淋巴器官所必需的（图1a）3。 CD40 - B细胞可以产生而没有从非常小，它可以进一步扩大在体外大量高纯度CD40的B细胞（&gt; 10 9细胞每名患者）从健康的捐赠者以及癌症金额外周血困难患者（图1c，d）项1,4。 在这个协议中，我们演示了如何获取充分激活的人PBMC CD40 - B从细胞。细胞培养的关键分子CD40配体，白细胞介素4（IL - 4）和环孢素A（CsA），这是在3-4天养殖周期的补充。 CD40的刺激对于实验室的目的是提供NIH/3T3细胞表达重组人CD40配体（tCD40L NIH/3T3）5。为了避免污染与非转染的细胞，表达人CD40配体的转染，定期进行检查（图）。 CD40 - B细胞培养，经过14天，包括95％以上的纯B细胞和CD40 - B细胞超过65天的扩张是没有任何损失的功能：1，4经常可能。 CD40 - B细胞的有效占用，过程和目前T细胞抗原6。他们不只有总理naϊve，而且还扩大记忆性T细胞7,8。 CD40激活的B细胞可用于研究B细胞的活化，分化和功能。此外，他们代表一个有前途的治疗或预防接种抗肿瘤9工具。

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Generation of Human CD40-activated B cells

在这个视频中，我们目前的<em&gt;体外</em&gt;的产生和扩大人CD40激活的B细胞（CD40 - B）从外周血单个核细胞（PBMC）的刺激与CD40配体和IL - 4。

人CD40激活的B细胞的生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

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15.1K 次观看.  University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine. 在这个视频中，我们目前的体外的产生和扩大人CD40激活的B细胞（CD40 - B）从外周血单个核细胞（PBMC）的刺激与CD40配体和IL - 4。