将对照和依托泊苷处理的生发囊泡或GV卵母细胞置于具有PFA-Tx 100缓冲液的不同塑料组织培养皿中，在室温下放置40分钟。在室温下用三种不同的50微升洗涤缓冲液冲洗卵母细胞，并将它们置于热块上的25微升封闭缓冲液中一小时。接下来，制备识别γ H2AX的一抗。
用封闭缓冲液以1：200的比例稀释一抗，并将卵母细胞浸入4摄氏度的15微升滴中过夜。在三种不同的50微升洗涤缓冲液中洗涤卵母细胞。准备Alexa Fluor 488偶联生长抗兔二抗。
用封闭缓冲液稀释后，将卵母细胞浸入15微升抗体滴中，在37摄氏度的热块上避光一小时。取远红色荧光DNA染料DRAQ7，在室温下在黑暗中将卵母细胞转移到其中10分钟，然后用三种不同的洗涤缓冲液洗涤它们。在35毫米玻璃底培养皿中向卵母细胞中加入一小滴洗涤缓冲液，用于共聚焦显微镜检查。
打开激光控制器和共聚焦系统中的激光器。打开显微镜控制器和灯后，打开共聚焦软件，选择40X油性镜头。将装有卵母细胞的培养皿放入标本支架中，并尝试通过使用操纵杆在 X、Y 和 Z 轴上移动载物台来聚焦卵母细胞。
为每个实验单独设置激光功率、增益和针孔尺寸，以最小化任何饱和度。对于每个卵母细胞，在DNA区域的细胞核中专门设置感兴趣的区域。定义 DNA 区域的边界并将 Z 步长调整为 3 微米。
然后开始扫描。将每个单元格的图像保存在所选文件夹中。打开 ImageJ 软件并单击图像，然后单击颜色和拆分通道。
拆分所有通道。单击查找表并为每个通道选择首选颜色 单击图像、颜色和合并通道以合并伽玛 H2AX 和 DNA 的通道。在具有高水平DNA损伤的包围核仁卵母细胞中，单击图像，堆栈，Z投影，然后使用手绘选择命令选择整个DNA区域。
单击分析，然后单击测量以测量伽马 H2AX 荧光并将测量结果复制到 Excel 文件中。依托泊苷处理后0小时包围核仁GV期卵母细胞中的γH2AX荧光如图所示。在所有依托泊苷浓度下，γ H2AX 在暴露后立即增加，并且增加与浓度相关。
此处显示了依托泊苷治疗后 20 小时包围的核仁 GV 期卵母细胞中的 γ H2AX 荧光。伽玛H2AX在所有依托泊苷浓度下暴露20小时后降低。在长时间的前期停滞后，GV期卵母细胞显示出降低γ-H2AX病灶数和强度的能力，这意味着在GV期停滞的卵母细胞中存在积极的修复过程。
