Isolation and Digestion of Mouse Carotid Artery for Single-Cell Suspension Preparation

首先，用75%酒精喷洒安乐死的小鼠。然后你消毒解剖剪刀，打开皮肤，露出胸腔。切开横膈膜，然后继续向上切至下颌，小心地去除多余的结缔组织和暴露颈动脉的脂肪。

接下来，切开下腔静脉，使血液从闭合的循环中流出。使用注射器将 20 毫升预冷灌注溶液缓慢注入左心室。将鼠标放在立体显微镜下。

然后用显微解剖剪刀，剥离颈动脉周围的脂肪和结缔组织。分离颈动脉并用PBS清洗，以冲洗掉任何残留的血液。将动脉转移到冰上含有1.5%FBS的六孔板中。

使用显微解剖剪刀，纵向解剖颈动脉，并将其平放在一个新的六孔板中，该孔板在冰上含有一毫升FBS。用FBS小心冲洗动脉内膜，以去除残留的血液。将动脉切成两毫米见方的组织块，并将它们转移到1.5毫升离心管中。

在4摄氏度下以400G离心5分钟，使组织沉入底部。弃去上清液，将组织重新悬浮在500微升解离试剂A.将试管置于37摄氏度的水浴中一小时，每10分钟用一毫升移液管轻轻移液。然后将 500 微升 5%FBS 加入试管中并充分混合。

通过无菌的 40 微米细胞过滤器将细胞悬液过滤到 1.5 毫升管中。然后将滤液离心并除去上清液，然后将沉淀重悬于200μL解离试剂B中，将试管置于水浴中，使细胞完全解离成单细胞悬浮液。五分钟后，加入 200 微升 5% FBS 以终止消化反应，离心悬浮液，弃去上清液，然后将沉淀重悬于冰上的 100 微升 PBS 中。

显微镜观察表明，与单独使用解离试剂A相比，将解离试剂B与试剂A联合使用可使颈动脉组织更彻底地解离。从9个左颈动脉中共收集了176,000个单细胞，其中大多数血管被成功解离为具有高活力的单细胞。消化后，基于SIRAH的无监督聚类揭示了正常小鼠颈动脉中的四种主要细胞类型。