在含有刚果红染料的琼脂平板上使用三条纹志贺氏菌菌株，以确保菌落具有毒性，并防止在感染测定中使用无毒菌落。首先，取过夜生长的志贺氏菌培养物并涡旋它们。在培养管中加入 100 微升培养物到 5 毫升新鲜 TSB 中。
在37摄氏度下孵育培养物，同时以250RPM振荡，直到在600纳米处达到0.7的光密度。将2乘以10转移到传代培养志贺氏菌的8个菌落形成单位到2毫升微量离心管中。通过在室温下以17,000g离心两分钟来沉淀细胞。
吸出上清液。加入一毫升温热的PBS，并彻底重悬沉淀。再次离心细胞后，将沉淀重悬于两毫升温热的DMEM中，并涡旋细胞悬浮液。
然后向六个孔板中的HT29结肠上皮单层的每个孔中加入一毫升重悬志贺氏菌和一毫升DMEM。为确保细菌与HT29细胞接触，在室温或37摄氏度下以2,000g离心六个孔板10分钟。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 6 块孔板 45 分钟。
为了确定细菌感染滴度，在PBS中制备重悬的志贺氏菌细胞的十倍连续稀释液。将 100 微升的 1 乘以 10 至 5 和 1 乘以 10 至 6 的稀释液用 TSB 铺在刚果红板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。孵育后，从每个孔中吸出培养基。
在每个孔中加入一毫升温热的PBS，然后轻轻清洗。然后加入两毫升温热的DMEM和每毫升庆大霉素50微克，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育30分钟。用一毫升PBS洗涤受感染的HT29细胞三次。
向每个孔中加入两毫升含有庆大霉素的温热DMEM，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育长达24小时，用于细胞内复制。在孵育结束时，用一毫升PBS洗涤细胞两次。向每个孔中加入一毫升含有 1%Triton X-100 的 PBS 以裂解 HT29 细胞。
然后使用细胞刮刀或弯曲的移液器吸头，从孔底刮取裂解的细胞，并将混合物转移到 1.7 毫升微量离心管中。涡旋每个试管至少 30 秒，以进一步从裂解的真核细胞中置换志贺氏菌。制备裂解物和PBS的十倍连续稀释液。
将 100 微升系列稀释液铺在装有 TSB 的刚果红板上，并在 37 摄氏度下孵育过夜。
