<p class="jove_content"作者希望感谢他们协助流式细胞仪分析和排序詹妮弗怪和格雷格·鲍曼。这项工作得到了NIH的资助从NCRR 2P20 RR020171和大学由肯塔基启动资金调频; GIE位承认总统的研究生奖学金和肯塔基机遇奖学金的支持。</p

1。分离人外周血单个核细胞（单核细胞从白膜） <ol><li>从医院或附近的血液中心位置，获得一个单位白膜。我们的血液中心提供约40-60毫升单位正常献血者中获得的棕黄色大衣。 </li><li>倒入蒸压500毫升玻璃瓶含无菌PBS稀释白膜血。最终体积的PBS +白膜应该是250毫升。 </li><li>装满十50​​ ml锥形管各20毫升Lymphoprep的解决方案。 </li><li>轻轻覆盖25毫升稀释白膜Lymphoprep解决方案，小心不扰乱Lymphoprep的解决方案的。 </li><li>在室温下30分钟500×Ğ旋转管。确保关闭离心机的制动，以便不打扰淋巴细胞分数。 </li><li>用吸管的Lymphoprep和等离子体介质层之间的接口在收集的外周血单核细胞。吸出，直到约1毫升血浆介质关闭仍然涵盖的的白膜层含有的单核细胞。使用10毫升吸管，单核细胞转移到一个新的50 mL管。 </li><li>用PBS洗涤细胞两次和然后悬浮在50毫升冷的RPMI上血球计数细胞。典型的复苏是8×10 8 - 1×10 9单核细胞。 </li></ol>此过程可缩减为较小的血液量。在PBS稀释的全血样本是1:1。 2。总的CD4 + T细胞的磁负选择，CD4 + CD45RA +幼稚T细胞或CD4 + CD45RO + +记忆T细胞使用EasySep富集试剂盒的单核细胞（干细胞的技术） 要遵循的步骤为1×10 8〜4.25×10 8单核细胞。 <ol><li>重悬单核细胞的终浓度为5×10 7 PBS中，每毫升含有2％FBS和1mM EDTA。细胞移动到一个新的14 mL聚丙烯圆底管。 <ol clasS =“lalpha”&gt; <li> 总人CD4 + T细胞的阴性选择分离：增加人体的CD4 + T细胞富集抗体鸡尾酒（50μL每毫升的外周血），混合，在室温下孵育10分钟。 </li><li> 人类幼稚T细胞的阴性选择分离：添加50μL抗CD45RO的每毫升外周血单个核细胞悬液，混合抗体，孵育15分钟，在室温下。加入浓缩试剂盒（50μL每毫升外周血），混合，在室温10分钟孵育提供的鸡尾酒。 </li><li> 人类的记忆性T细胞的阴性选择分离：添加人类记忆CD4 + T细胞富集抗体鸡尾酒（50μL每毫升的外周血），混合孵育10分钟，在室温下。 </li></ol></li><li>混合磁性粒子，平均分配在整个解决方案。做不涡纳米粒子，从天真套件。 </li><li>添加磁性颗粒（100μL，每毫升的外周血总CD4 +幼稚T细胞的选择，50μL每毫升的外周血记忆性T细胞的选择）。混合轻轻吹打在室温下的2-3倍，并培育幼稚T细胞的选择10分钟或5分钟内存或总的CD4 + T细胞的选择。 </li><li>添加PBS包含2％胎牛血清和1 mM的EDTA带来量高达每管10毫升。混合轻轻吸取前封顶管总的CD4 + T细胞，幼稚和记忆亚群，分别为5年，10或2.5分钟放入银EasySep磁铁的2-3倍。 </li><li>管仍然在EasySep磁铁，注入新的50 mL试管液体隔离感兴趣的细胞。 </li><li>重复步骤2.5和2.6为更好地恢复。 </li></ol> 3。细胞培养条件诱导调节性T细胞<ol><li>步骤1和2，大衣组织培养板前一天先稀释的抗CD3抗体（OKT3治疗克隆）1微克/毫升无菌PBS浓度。 6孔板，加入2毫升的PBS +每口井的抗CD3，12孔板，加1毫升，或24孔板，每孔加500μL的。保持涂层板在4°C，直到使用。 </li><li>准备加入RPMI-1640前用2.06毫米补充Glutamax-I和25毫米的10％热灭活小牛血清（FBS），100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素和50μMβ-巯基乙醇介质极化HEPES缓冲。接下来，添加2毫微克/毫升TGF-β和5 ng / ml的IL-2。在这里，人们可以添加媒体感兴趣的配体或抑制剂。悬浮细胞从第2步，在2×10 6细胞/毫升的极化介质的浓度。 </li><li>预暖板在37°C和吸PBS的抗CD3涂井前加入细胞。 6孔板，12孔板或24孔板1毫升细胞2毫升细胞，加入4毫升，每孔细胞悬液。填补井空，以减少水分蒸发，用PBS媒体。在37°C / 5％CO 2孵育3天。 </li><li>第3天后电镀，降速为5分钟离心500×Ğ板。不打扰板底部的T细胞，取出一半的媒体和新媒体取代。另外，如果井变得人满为患与细胞（3×10 6 /毫升以上的浓度），平分到另一个抗CD3涂层板的体积和补充新鲜媒体回升到原来体积。两到三个多天在37°C / 5％CO 2孵育。 </li></ol> 4。荧光激活细胞分选（FACS）T细胞群体<ol><li>准备加入0.5％（W / V）牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的无菌PBS洗涤液的流式细胞仪。地方缓冲区在4°C至冷。 </li><li>删除从细胞培养细胞，每孔2毫升的PBS冲洗，以确保完整的细胞恢复。将50毫升聚丙烯管的所有细胞，离心10 500 XG分钟，在4°C。 </li><li>血球计数细胞，以确定细胞密度。 </li><li>地方3-5×10 5细胞每管四个独立的5毫升圆底聚苯乙烯补偿控制管。将50毫升聚丙烯管，不超过35×10 6个细胞管中剩余的细胞。 </li><li>降速细胞在4°C和抽吸介质为5分钟。悬浮细胞在90μL冷水洗每1×10 6细胞的缓冲区排序。悬浮在100μL冷洗涤液的补偿控制管。 </li><li>对细胞进行排序，结合抗CD25-PE，2μL的反CD45RA的PE-Cy5的3μL，1μL，每1×10 6细胞的抗CD127-APC。没有抗体补偿控制管，2μL抗CD25-PE的第二管，抗CD45RA的3μL - PE-Cy5的第三管AND1μL抗CD127-APC第四管。冰上孵育45分钟，在黑暗中所有的管子。 </li><l&gt;冷洗涤液加入10毫升的细胞进行排序和1毫升的补偿控制管。离心5分钟，所有的细胞在500 XG 4°C。 </li><li>吸在1×10 7细胞每毫升洗涤液浓度的缓冲和重悬细胞。通过40微米尼龙细胞过滤器过滤前添加的DNase II的细胞每毫升1.5μL。将细胞要多5 mL圆底聚丙烯管，每管不超过3.5毫升。补偿控制细胞重悬于300μL洗涤液。 </li><li>补偿设置上MoFlo流式细胞仪的PE，APC和PE-Cy5的过滤器，以尽量减少交叉检测。设置门排序iTregs（CD25表达喜 CD127 -/LOW CD45RA的-细胞）5 mL圆底聚苯乙烯管含有1 mL的小牛血清T细胞，幼稚（CD25-CD45RA的+）和内存（CD25表达- - CD45RA的）。 </li></ol> 5。制止含量<ol><li>使suppr加入100的U / ml青霉素，链霉素100微克/毫升，5毫微克/毫升的IL-2和2毫微克/毫升，TGF-β在AIM-V的分裂国家法媒体。 </li><li>每天的检测，净化异的CD4 + T为细胞在步骤1和2表示从白膜。这些都将抑制试验的靶细胞和不含有CD25 + Treg细胞，可以看到在图2 0日。 </li><li>标签细胞CellTrace套件，为制造商的指示，只用1μL5毫米，每毫升的细胞，而不是2μL，原液除外。直接光了，一小瓶CFSE标记添加18μL二甲基亚砜提供由CellTrace套件做一个5毫米的原液。悬浮在预热的PBS + 0.1％（W / V）牛血清白蛋白的靶细胞所需数量（最高为1×10 7）至终浓度为1×10 6细胞/ ml。加入1μL5毫米每毫升细胞CFSE标记，并在37℃水浴中孵育5 minutES。加入含10％胎牛血清5卷完整的，冰冷的RPMI，解渴染色并在冰上孵育5分钟。洗净用冷水完整的RPMI 1重悬细胞两倍以上×10 5细胞每100μL抑制法媒体。 </li><li> Treg细胞抑制督察珠的股票在2×10 7珠/毫升的浓度。颗粒的珠子数量等于每Eppendorf管中的快速离心实验细胞的总数。一次洗珠用RPMI和再沉淀。的RPMI愿望后，重悬珠，使每口井珠适量8μL抑制法媒体。 </li><li>到96圆底培养板，添加CFSE染色的细胞（1×10 5细胞/ ml），督察珠和新鲜抑制试验介质的极化和排序细胞（1×10 5细胞/ ml）到一个理想的目标（CFSE染色）：在200微升的最终体积效应（排序）的比率。所有条件都在tripli设置盖茨。 </li><li>准备加入100μLCFSE染色的细胞，8μL督察珠和1×10新鲜的，未染色的细胞，每孔92μL抑制试验介质的两个控制条件。与上述相同的细胞成分，但没有调节性T细胞督察珠准备第二控制。 </li><li>覆盖在37°C / 5％CO 2板铝箔，并培育了五天。 </li><li>在黑暗中，从每口井的细胞收集在5 mL圆底聚苯乙烯管的移液器和地点。离心5分钟，在500 XG细胞在4°C时，抽吸介质，并从第4步洗涤缓冲液在300冷流式细胞仪悬浮。分析的第一个3×10 4 CFSE标记+代表靶细 ​​胞与细胞Quest软件的直方图从现场淋巴细胞门事件。 </li></ol> 6。代表结果例如，流式细胞仪伪点缀了为期五天的时间，凑地块RSE的监测iTreg分化的基础上共同表达的CD25与FOXP3的相对，CTLA-4和CD45RA的可以看出，在图2。在图3中的直方图显示了一个成功的抑制实验中排序iTregs（CD25表达喜 CD45RA的-细胞CD127 -/LOW）。为期五天的文化，已获得监管/抑制能力是唯一的一个子集， 图4显示了调节性T细胞诱导从一个天真的T细胞池（顶部面板）和记忆T细胞池（底板）后五天文化标准iTreg介质。 CFSE标记的原始细胞染色表明，无论是天真的（右上面板）或记忆T细胞（右下面板）区分只经过几轮细胞分裂到iTregs（最高Foxp3的表达）。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 图1。实验过程示意图。外周血ART细胞-通过梯度离心分离出人外周血前磁+ CD25表达的CD4阴性选择E。 5至6天培养后，细胞进行流式细胞仪，并与异CFSE标记靶细胞共同孵育测量抑制活性。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 图2纯化的人主要的CD4 + CD25 - T细胞培养iTreg介质。等份细胞被收集后隔离（0天），并在细胞培养1天，3和5，监察CD45RA的，FOXP3，CTLA-4和CD25标记的进展。 iTreg轮廓对应CD45RA的- ，FOXP3 嗨 ，CTLA-4 高和CD25 HI（在图形窗口中高亮显示）。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 纯化的CD4 + CFSE标记拉图3。贝莱德细胞（1×10 5 /孔）培养中存在天真排序，内存或iTreg细胞的调节性T细胞抑制督察珠 （3×10 4 /孔）。五天后，细胞收获和染细胞的流式细胞仪检测CFSE标记的文件。 iTreg细胞的存在，完全废除的CD4 + T细胞的增殖。有数字表明CFSE标记的细胞发生分裂的百分比。 <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 图4纯化的人类主要天真（的CD4 + CD25 - CD45RA +）和内存（的CD4 + CD25 - CD38 +）T细胞被染色CFSE和培养iTreg中等。五天后，细胞phenotyped和细胞分裂率估计。 如图2所示，从两个亚群分化的iTreg子集对应CD45RA的- CD25表达喜 FOXP3 高和CTLA-4 高 （后者未显示）。比较CFSE染色型材iTregs（这里的最高表达Foxp3的T细胞）识别在为期五天的文化最增殖细胞。

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	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. 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作者没有透露。

虽然拥有巨大的调节性T细胞的转移在打击自身免疫排斥反应和其他免疫或炎症介导的疾病，其高效发电和维护稳定的方法治疗的承诺尚未开发。由于只有1-5％的循环人类T细胞是调节性T细胞，他们控制的扩张和分化克服这种缺乏作为实施调节性T细胞进入临床的主要威慑。另一方面，我们从审判13 TGN1412了解到，这是科学和伦理的必要深入了解分子事件，编排实施任何治疗方案之前，人类T?...

<table border="1"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> lymphoprep </td><td>轴盾</td><td> 1114547 </td><td>保持室温</td></tr><tr><td>冷冻台式离心机</td><td> Eppendorf公司</td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td>亮线血球</td><td>豪塞尔科学</td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep人类CD4 + T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep人类记忆CD4 + T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep人类朴素的CD4 + T细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td>大易EasySep MAG净</td><td>干细胞技术</td><td> 18001 </td><td>银</td></tr><tr><td> 5 mL圆底聚苯乙烯管</td><td>屋宇署猎鹰</td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mL聚丙烯离心管</td><td>厂商VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 mL聚丙烯圆底管</td><td>屋宇署猎鹰</td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 mL聚丙烯离心管</td><td>厂商VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td>人类抗CD3抗体</td><td>生物X手机</td><td> BE0001-2 </td><td>克隆：OKT3治疗</td></tr><tr><td> 24孔细胞聚苯乙烯培养板</td><td>屋宇署猎鹰</td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96井圆底培养板</td><td>格雷尼尔生物一</td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I和HEPES缓冲的RPMI 1640 </td><td> Gibco公司</td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td>胎牛血清（FBS）， </td><td> Gibco公司</td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-巯基乙醇</td><td>西格玛</td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td>重组人转化生长因子-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA） </td><td> MP Biomedicals公司</td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M的EDTA </td><td> AMRESCO </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人CD25 - PE </td><td>美天旎生物技术</td><td> 130-091-024 </td><td>克隆：4E3 </td></tr><tr><td>鼠抗人CD45RA的PE-Cy5的</td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td>克隆：HI100 </td></tr><tr><td>鼠抗人CD127-APC </td><td>美天旎生物技术</td><td> 130-094-890 </td><td>克隆：MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNA酶二</td><td>中号带够Biomedicals公司</td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo流式细胞仪</td><td>贝克曼</td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo软件</td><td>树星公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞任务Pro软件</td><td> BD公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td> Gibco公司</td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-谷氨酰胺</td><td> Gibco公司</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V的</td><td> Gibco公司</td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE标记细胞增殖试剂盒</td><td> Invitrogen公司</td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg细胞抑制督察珠</td><td>美天旎生物技术</td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td>青霉素链霉素</td><td> Gibco公司</td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40微米尼龙细胞株呃</td><td>屋宇署猎鹰</td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

免疫的CD4 +调节性T细胞（Tregs）的开发和维护，促进周边的宽容，需要保持大量对人体的自我和共生抗原在免疫稳态。调节性T细胞和炎症常规T细胞之间的平衡扰动可导致免疫病理或癌症。虽然已被证明是4几个根本的分歧在人类与小鼠的调节性T细胞生物学5 1，I型糖尿病，类风湿关节炎和移植物抗宿主病，结肠炎的小鼠模型中的有效调节性T细胞治疗注射迄今排除了临床使用。由于缺乏足够数量，纯度，稳定性和特异性治疗调节性T细胞归巢的需要Treg的人类发展的动力平台上，以优化条件下体外扩增 6。 在这里，我们倒是描述一个从一个单一的人外周血献血，其中可分为四个阶段的分化诱导调节性T细胞（iTregs）分离外周血单个核细胞，CD4 + T细胞磁性选择的方法： 在体外细胞培养和荧光激活T细胞亚群细胞分选（FACS）。由于Treg的签名转录因子叉头框P3（FOXP3）是人类7激活诱导的转录因子，并没有其他存在独特的标记，标记的组合面板必须用于识别与抑制活性的T细胞。 6天培养后，细胞在我们的系统可以被划分成幼稚T细胞，记忆T细胞或基于其相对表达CD25，CD45RA的iTregs。由于内存和幼稚T细胞有不同的极化要求和可塑性8，牛逼成CD45RA +和CD45RO细胞人口的初始预分拣+亚群可以E中检查这些差异。与他人一致，CD25表达喜 CD45RA的- iTregs快递高水平的FOXP3 9，GITR和CTLA-4的第11和CD127 12的水平低。按照每个人口的流式细胞仪，由此产生的细胞可用于在评估相对延缓羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自体T细胞增殖能力的抑制实验。

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

我们描述了从一个单一的人献血的监管，内存和幼稚T细胞产生的一种方法。极化调节性T细胞可以比较多种遗传同质性，这里还详细介绍了包括抑制法与遗传和功能应用中的其他子集。

从初级人类的幼稚和记忆T细胞的诱导调节性T细胞的生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

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Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K 次观看.  University of Kentucky. 我们描述了从一个单一的人献血的监管，内存和幼稚T细胞产生的一种方法。极化调节性T细胞可以比较多种遗传同质性，这里还详细介绍了包括抑制法与遗传和功能应用中的其他子集。