<p class="jove_content"&gt; 저자 유동세포계측법 분석 및 정렬와의 도움 제니퍼 이상하고 그렉 Bauman 감사하고 싶습니다. 이 작품은 FM으로 NCRR에서 NIH 그랜트 번호 2P20 RR020171 의해 켄터키 시작 자금의 대학에 의해 지원되었다; GIE는 대통령 대학원 원정대와 켄터키 기회의 원정 지원을 인정한다.</p

1. 버피 코트에서 사람 말초혈 Mononuclear 전지 (PBMCs)의 분리 <ol><li> 병원이나 인근의 혈액 센터 위치에서 버피 코트 하나의 단위를 취득. 우리의 혈액 센터는 정상적인 혈액 기증자로부터 얻은 단위당 버피 코트 40-60 대한 ML 우리에게 제공합니다. </li><li> 버피 코트를 희석하기 위해 멸균 PBS를 포함하는 autoclaved 500 ML 유리 병으로 혈액을 붓고. PBS + 버피 코트의 최종 부피 250 ML이어야합니다. </li><li> 20 ML의 Lymphoprep 솔루션으로 각 열 50 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. </li><li> 부드럽게 Lymphoprep 솔루션을 방해하지 않도록주의되는 희석 버피 코트의 25 ML과 Lymphoprep 솔루션을 입혀라. </li><li> 500 X g에서 실온에서 30 분간 튜브를 봐. 림프구 분율을 방해하지 않는만큼, 원심의 브레이크를 해제해야합니다. </li><li> 피펫으로 Lymphoprep 및 플라즈마 - 중간 계층 간의 인터페이스에서 PBMCs를 수집합니다. 약 1 ML까지 플라즈마 - 중간 오프를 기음아직 PBMCs을 포함 버피 코트 레이어를 다룹니다. 새로운 50 ML 관에 PBMCs를 전송하는 10 ML의 피펫을 사용합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어 후 hemocytometer 의지에 대한 차가운 RPMI의 50 ML에 세포를 resuspend. 1 X 10 9 PBMCs - 일반적인 복구는 8 × 10 8이다. </li></ol> 이 절차는 혈액의 작은 볼륨 크기를 줄일 수 있습니다. 전체 혈액 샘플의 희석은 PBS에 1시 1분입니다. 2. 총 CD4의 자기 부정적 선택 + T 세포, CD4 + CD45RA + 나이브 T의 셀 또는 CD4 + CD45RO + EasySep 농축 키트를 사용하여 PBMCs에서 메모리 T 세포 (줄기 세포 기술) 4.25 X 10 8 PBMCs ~ 1 × 10 8시 따라야 할 단계. <ol><li> 2퍼센트 FBS 및 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS에서 ML 당 5 × 10 7의 최종 농도로 Resuspend의 PBMCs. 신선한 14 ML의 폴리 프로필렌 원형 바닥 튜브에 세포를 이동합니다. <ol clasS = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> 총 인간의 CD4 + T 세포가 부정적인 선택에 의한의 분리 : 인간의 CD4 + T 세포 농축 항체의 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스와 실온에서 10 분간 부화를 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간 나이브 T 세포의 격리가 : PBMC의 세포 현탁액, 믹스 ML 당 방지 CD45RO 항체의 50 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 10 분간 상온에서 키트 (PBMCs의 당 ML 50 μL), 믹스와 부화와 함께 제공되는 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 부정적인 선택에 의해 인간의 기억 T 세포의 격리는 : 인간 메모리 CD4 + 항체의 T 세포 농축 칵테일 (PBMCs의 ML 당 50 μL), 믹스를 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 동등 솔루션 전반에 걸쳐 그들을 배포할 잘 자성 입자를 섞는다. 나이브 키트에서 와동하지 nanoparticles 해. </li><li> 자성 입자를 (100 총 CD4위한 PBMCs의 ML 당 μL +와 나이브 T 세포 선택, 메모리 T 세포 선정 PBMCs의 ML 당 50 μL) 추가합니다. 부드럽게 나이브 T 세포 선택을위한 10 분 또는 메모리 또는 총 CD4 + T 세포의 선택 5 분 동안 상온에서 3 배 및 부화를 pipetting하여 섞는다. </li><li> PBS가 튜브 당 10 ML에 볼륨을 가져 2퍼센트 FBS와 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 추가합니다. 부드럽게 총 CD4 + T 세포, 순진 및 메모리 하위 집합 각각에 대해 5, 10 또는 2.5 분 실버 EasySep 자석으로 uncapped 튜브를 삽입하기 전에 3 배를 pipetting하여 섞는다. </li><li> 여전히 EasySep 자석의 튜브를 통해 관심있는 세포를 분리하기 위해 새로운 50 ML 튜브에 액체를 부어. </li><li> 단계 2.5 나은 복구를 위해 2.6을 반복합니다. </li></ol> 3. 세포 배양 조건 규제 T 세포를 유도해야 <ol><li> 에 의한 1 단계와 2 단계, 코트 조직 배양 플레이트 전날 먼저 (안티 인 경우에는 3 번 CD 항체를 diluting멸균 PBS 1 μg / ML의 농도에 OKT3 클론). 6 잘 접시는 PBS의 2 ML + 잘마다 안티 인 경우에는 3 번 CD를 추가할 경우, 12도 접시 1 ML을 추가 또는 24도 접시 당 500 μL 잘 추가하십시오. 코팅 번호판 4시 ° C에서 사용할 때까지 유지. </li><li> RPMI-1640 2.06 밀리 권총을 미리 보충 Glutamax - 전 25 MM 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신 및 50 μm의 β-메르 캅 토 에탄올을 추가하여 편광 매체를 준비합니다 HEPES 버퍼. 다음, 2 NG / ML TGF-β와 5 NG / ML IL-2를 추가합니다. 여기, 한 리간드 또는 미디어에 관심 억제제를 추가할 수 있습니다. 2 X 10 6 세포 / 편광 매체 ML의 농도에서 2 단계의 세포를 Resuspend. </li><li> 37 미리 따뜻한 접시 ° C와 세포를 추가하기 전에 안티 인 경우에는 3 번 CD-코팅 우물의 PBS를 기음. 6 잘 접시, 24 잘 접시 12 잘 접시 또는 세포의 1 ML에 대한 세포의 2 ML에 대해 4 ML 당 우물의 세포 현탁액을 추가합니다. 의 증발을 줄이기 위해 PBS와 빈 우물을 채워미디어. 37 ° C / 5% CO 2에서 3 일 동안 알을 품다. </li><li> 3 일 게시물 도금에서, 500 X g에서 5 분간 원심에서 접시를 돌리다. 접시의 바닥에 T 세포를 방해하지 않고, 미디어의 절반을 제거하고 새로운 미디어로 바꿉니다. 우물이 세포 (3 × 10 6 / ML 이상의 농도)로 초만원 된 경우 또는, 동등하게 다른 반 인 경우에는 3 번 CD 코팅 강판으로 볼륨을 분리하고 원래의 볼륨으로 다시 새로운 매체를 추가하십시오. 37 ° C / 5% CO 2에 두명 게 세 일 동안 알을 품다. </li></ol> 4. T 세포의 세 인구의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) <ol><li> 멸균 PBS에 0.​​5 % (W / V) 소 혈청 알부민 (BSA)과 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하여 버퍼를 세척 FACS를 준비합니다. 4에 플레이스 버퍼 ° C 감기 얻으려고 말야. </li><li> 잘 세포 배양에서 세포를 제거하고 전체 세포 회복을 위해 PBS의 2 ML 각 우물을 린스. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에있는 모든 세포를 놓고 10 500 XG에 원심 분리기분 4에 ° C. </li><li> 세포 밀도를 결정하는 hemocytometer에 세포를 세어보세요. </li><li> 장소 3-5 보상 컨트롤에 대한 각자 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 튜브 회 × 10 5 세포. 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브, 튜브 당 더 이상 35 이상 X 10 6 세포에 남아있는 세포를 놓습니다. </li><li> 4 ° C와 대기음 미디어에서 5 분 동안 세포를 내려 봐. 1 X 10 6 세포마다 추위 세척 버퍼의 90 μL으로 정렬되는 세포를 Resuspend. 감기 세척 버퍼 보상 제어 튜브의 100 μL에 Resuspend. </li><li> 정렬되는 셀, 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA-PE-Cy5 3 μL 및 1 회 안티 CD127-APC의 1 μL X 10 6 세포를 결합. 네 번째 튜브에 방지 CD127-APC의 세 번째 튜브 and1 μL로 PE-Cy5 - 최초의 보상 제어 튜브, 두 번째 튜브에 안티 CD25-PE 2 μL, 안티 CD45RA 3 μL에 아무런 항체를 추가 없습니다. 어둠 속에서 45 분 동안 얼음에있는 모든 튜브를 품어. </li><li&gt;는 정렬되는 셀 및 보상 제어 튜브 1 ML에서 차가운 세척 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 4에서 5 분 500 XG에서 모든 세포를 원심 ° C. </li><li> 버퍼를 세척의 ML 당 1 X 10 7 세포의 농도에서 버퍼와 resuspend 세포를 기음. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 필터링하기 전에 세포의 ML 당 DNase II 1.5 μL를 추가합니다. 관 당 더 이상 3.5 이상 ML 여러 다섯 ML의 원형 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 세포를 이동합니다. 버퍼를 닦고 300 μL로 보상 제어 세포를 Resuspend. </li><li> PE, APC와 PE-Cy5 필터에 의해 교차 검출을 최소화하기 위해 MoFlo 흐름 cytometer에 대한 보상을 설정합니다. 한 ML 갓 태어난 송아지의 혈청을 포함하는 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 T 세포, 순진 (CD25-CD45RA +)와 메모리 (CD25 - - CD45RA) - iTregs을 (세포가 CD25 하이 CD127 -/LOW CD45RA) 정렬 게이트를 설정합니다. </li></ol> 5. 억제 분석 <ol><li> suppr 만들기ession 분석의 100 U / 페니실린의 ML, 스트렙토 마이신 100 μg / ML, 5 NG / ML IL-2 및 TGF-β에 AIM-V의 2 NG / ML를 추가하여 미디어. </li><li> 분석의 날, heterologous CD4 +와 같은 1 단계와 2 단계에 표시된 버피 코트에서 T 세포를 정화. 이것은 억압 분석의 대상 세포되며 그림 2 주 0에서 볼 수 있듯이, CD25 + Treg 세포를 포함하지 않습니다. </li><li> 세포 대신에 2 μL의 ML 당 5 밀리미터 주식 솔루션의 1 μL를 사용을 제외한 제조 업체의 지침에 따라 같은 CellTrace 키트와 라벨 세포. 직접 빛으로부터 밖으로 유지할 수있다는 것은, 5 밀리미터 주식 솔루션을 만들기 위해 CFSE 중 하나를 유리병에 CellTrace 키트가 제공 DMSO 18 μL를 추가합니다. 1 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도로 prewarmed PBS + 0.1 % (W / V) BSA의 대상 세포의 필수 수를 (1 × 10 7 최대) Resuspend. 세포의 ML 당 5 밀리미터 CFSE 1 μL를 추가 및 5 minut 위해 37 ° C의 물을 욕조에 품어네;. 염색법을 끄다 5 분 동안 얼음에 품어 10 % FBS와 완전 얼음 차가운 RPMI 5 볼륨을 추가합니다. 추위 전체 RPMI 및 resuspend 1 회 이상 전지 × 10 억제 분석 매체의 100 μL 당 5 세포. 씻으십시오 </li><li> Treg 억제 감독관 구슬은 2 X 10 7 구슬 / ML의 주식 농도에 있습니다. 구슬의 펠렛 숫자 eppendorf 튜브에 빨리 원심 분리하여 실험 당 세포의 총 수를 같음. RPMI하고 다시 펠렛과 함께 한 구슬을 씻는다. RPMI의 흡인 후 resuspend 비즈 일이 잘되어 당 구슬의 해당 금액은 억제 분석 매체의 8 μL에 있다고. </li><li> 96 잘 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에, 원하는 대상에 CFSE 묻은 세포 (1 × 10 5 세포 / ML), 경위 비즈와 신선한 억제 분석 미디어의 편광과 정렬된 세포 (1 × 10 5 세포 / ML)을 추가 (CFSE의 스테인드) : 200 μL의 최종 볼륨에서 효과기 (정렬)의 비율. 모든 조건은 tripli에서 설정합니다cates. </li><li> 물론 당 92 μL 억제 검정 매체에 CFSE의 스테인드 세포 100 μL, 경위 비즈 8 μL 신선한, 흠없는 세포 1 × 10 5를 추가하여 두 제어 조건의 첫 번째를 준비합니다. 위와 같은 세포 구성 요소지만, 감독관 비즈를 Treg 않고 두 번째 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 5 일 동안 37 ° C / 5% CO 2로 알루미늄 호일과 부화에 커버 플레이트. </li><li> 어둠에서 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 pipetting과 장소에 의해 각각의 우물에서 세포를 수집합니다. 4 ° C, 기음 미디어에서 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기, 그리고 4 단계에서 버퍼를 닦고 300 μL 추운 FACS에 resuspend. 처음 3 X 10 4 CFSE + 세포 퀘스트 소프트웨어와 히스토그램에서 대상 세포를 대표하는 라이브 림프구 게이트에서 이벤트를 분석. </li></ol> 6. 대표 결과 흐름 cytometric pseudocolor의 예 5 일간의 시간을 기 이상의 플롯을 점rse 모니터링 iTreg 차별이 FoxP3과 CD25의 공동 표현 상대를 기반으로, CTLA-4 및 CD45RA는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 3의 히스토그램은 iTregs (CD25 하이 CD45RA - CD127 -/LOW 세포)가 정렬되는 성공적인 억압 분석 보여줍니다. 규제 / 억제 능력을 인수했다고 5 일 문화의 유일한 부분 집합이다를 그림 4는 Tregs의 유도를 보여줍니다 나이브 T 세포 풀 (상단 패널) 및 표준 iTreg 매체에서 5 일간의 문화 이후에 메모리 T 세포 풀 (하단 패널)에서. 초기의 세포 CFSE의 염색법 역시 순진 (오른쪽 위 패널) 또는 메모리 T 세포 (하단 오른쪽 패널) 만 세포 분열 몇 라운드 후 iTregs (최고 FoxP3 - 표현 세포)로 구분 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 절차의 도식. PBMCs ART 세포 - + CD25 CD4의 자기 부정적인 선택을하기 전에 기울기 원심 분리를 통해 인간의 말초 혈액 중에 분리 5. 문화 5-6일 후, 세포는 FACS를 받아야하고 진압하는 활동을 측정하는 heterologous CFSE 분류 대상 세포와 공동 incubated됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 그림 2 죄를 씻고 인간의 기본 CD4 + CD25 -. T 세포가 매체를 iTreg에서 배양해 있습니다. 세포가 나누어지는가 CD45RA, FoxP3, CTLA-4와 CD25 마커의 진행 상황을 모니터링하는 단지 격리 (매일 0) 이후 및 일 1, 3 및 세포 배양 5에서 수집됩니다. iTreg 프로필 CD45RA에 해당 - FoxP3 안녕하세요, CTLA-4와 CD25 안녕 안녕하세요 (인 - 그래프 창에 강조). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> 그림 3. + CFSE 라 CD4 투석을beled 세포 (1 × 10 5 / 잘가) 정렬 순진, 메모리 또는 iTreg 세포의 면전에서 억제 경감 구슬을 Treg 함께 배양해있다 (3 × 10 4 /도).에게 5 일 후에 세포가 수확되고 스테인드 세포 CFSE 프로필이 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. iTreg 세포의 존재는 완전히 CD4의 확산 + T 세포를 abolishes. 숫자 본부받은 CFSE-라벨이 세포의 비율을 나타내는입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> 그림 4 인간의 기본 순진 죄를 씻고. (CD4 + CD25가을 - CD45RA +)와 메모리 (CD4 + CD25 - CD45RO +) T 세포가 CFSE와 매체 iTreg의 교양 물들일 수 있습니다. 5 일 후에 세포 phenotyped과 세포 분열 속도가 예상됩니다. 다른 이름으로 그림 2에 표시된 두 집합에서 차별 iTreg 집합은 해당CD45RA - CD25 안녕 FoxP3 하이와 CTLA-4 안녕하세요 (후자이 보이지 않음). 비교 CFSE의 염색법 프로필은 5 일 문화 중 가장 proliferative 세포로 iTregs를 (여기서는 가장 높은 표현 FoxP3 T 세포 등)를 확인하실 수 있습니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

Treg 전송, 그들의 효율적인 생성 및 안정적인 유지 보수 방법을 autoimmunity 그래프트 거절 및 다른 면역 또는 염증 - 매개 질환을 퇴치에 엄청난 치료 가능성을 가지고 있지만 아직 개발되지 않았습니다. 인간의 T 세포를 순환만이 1-5%는 Tregs가로서 자신의 제어 확장과 차별화는 병원에 Tregs의 구현의 주요 억지력으로 소수를 극복. 우리가 TGN1412 재판 13 일부터 배운대로 반면에, 그것은 심히 ?...

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> 축 - 방패 </td><td> 1,114,547 </td><td> 실온에서 보관 </td></tr><tr><td> 냉장 벤치 - 탑 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> 밝은 라인 Hemocytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 메모리 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 나이브 CD4 + T 세포 강화 키트 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 19,155 </td><td></td></tr><tr><td> 빅 쉬운 EasySep 매기그물 </td><td> 셀 기술을 막기 </td><td> 18,001 </td><td> 은화 </td></tr><tr><td> 5 ML 라운드 히프 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ML의 폴리 프로필렌은 라운드 - 어쨌든 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 안티 인 경우에는 3 번 CD 항체 </td><td> 바이오 엑스 셀 </td><td> BE0001-2 </td><td> 클론 : OKT3 </td></tr><tr><td> 24 자 셀 폴리스티렌 문화 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 자 라운드 히프 조직 배양 플레이트 </td><td> Grenier 바이오 원 </td><td> 650,180 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-I와 HEPES 버퍼와 RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 72,400 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16,000 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> TGF-β1 재조합 인간 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 810,531 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> 클론 : 4E3 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> 클론 : HI100 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> 클론 : MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals 주식 회사 </td><td> 190,370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo 흐름 Cytometer </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 소프트웨어 </td><td> 트리 스타 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세포 퀘스트 프로 소프트웨어 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 갓 태어난 송아지 고기 세럼 </td><td> Gibco </td><td> 16,010 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0,870,112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace의 CFSE의 세포 증식 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> 억제 검사기 비즈를 Treg </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm의 나일론 셀 스트레인어 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

면역 CD4 + 규제 T 세포 (Tregs)의 개발과 유지 보수 및 인체에 대한 자신과 공생 항원의 광대한 양의 immunologic의 항상성 유지에 필요한 말초 관용에 기여한다. Tregs 및 염증성 종래의 T 세포 사이의 균형을 Perturbations는 immunopathology이나 암이 발생할 수 있습니다. Tregs의 치료 주사는 대장염 1, 유형 I 당뇨병 2, 류마티스 관절염 및 이식편 대 숙주 질환, 인간 대 마우스 Treg 생물학 5 4 몇 가지 근본적인 차이점 murine 모델에 효과있는 것으로 표시되었지만 지금까지 임상 사용을 배제하고있다. 충분한 숫자, 순도, 안정성 및 치료 Tregs의 유도 특이성의 부족들이 전직 생체내 확장 6 조건을 최적화할 수있는 인간 Treg 개발의 역동적인 플랫폼을 necessitated. 여기 D4 단계로 세분 수있는 단일 인간의 말초 혈액 기증자로부터 유도된 Tregs (iTregs)의 차별 화를위한 방법 방접원을 그리다 : 말초 혈액 mononuclear 세포, CD4의 자기 선택 + T 세포의 절연, 체외 세포 배양 및 형광의 활성화 T 세포 하위 집합의 셀 정렬 (FACS). Treg 서명 전사 인자의 forkhead 상자 P3 (FoxP3)는 인간 7의 활성화 유발 전사 인자이며 다른 독특한 마커 존재 마커 조합 패널 억제 활동과 T 세포를 식별하는 데 사용해야하기 때문에. 문화에 6 일이나하면 Google 시스템에서 세포 나이브 T 세포, CD25 및 CD45RA들의 상대적인 표현을 기반으로 메모리 T 세포 또는 iTregs로 demarcated 수 있습니다. 메모리와 나이브 T 세포가 다른보고 편광 요구 사항 및 plasticities 8을 가지고로서 CD45RA +와 CD45RO로 초기 T 세포 인구의 사전 분류 + 하위 집합 수 B전자는 이러한 불일치를 검사하기 위해 사용됩니다. 다른 사람과 일치하는, 우리의 CD25 안녕 CD45RA - FoxP3 9 iTregs 명시적 높은 수준의, GITR 및 CTLA-4 11 CD127 12 낮은 수준. 각 인구의 FACS 따라 결과 세포 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) - 라벨 T 세포 autologous의 확산을 병신하는 상대적 능력을 평가하고 억압 분석에 사용할 수 있습니다.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K 조회수.  University of Kentucky. 우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.