This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.

该协议遵循动物研究伦理委员会的LUMC准则。 1.准备仪器，培养基和MTCS 注：请在层流罩的所有准备工作。该MTCS灌注腔，泡沫陷阱，站在利伯等人 ，2010 11描述。 <ol><li>消毒镊子和微型剪刀用70％的乙醇。制备一个5毫升注射器用21G针用无菌台氏缓冲液（130毫摩尔NaCl，5.4毫米氯化钾，6.0毫摩尔的Hepes，1.2mM的MgSO 4干燥，1.2mM的磷酸二氢钾 ，20mM的葡萄糖，1.5mM的氯化钙 2·2H 2 O， pH值= 7.2）。制备一个5毫升注射器用21G针用无菌KCl溶液（100毫摩尔）。 </li><li>制备65毫升每心脏培养基：DMEM补充有10％胎牛血清，抗生素/抗真菌剂（A / A; 100单位的青霉素，100微克的链霉素和0.25微克两性霉素B / ml）的胰岛素转铁硒（ITS; 10微克/毫升的胰岛素，5.5微克/毫升运铁蛋白，6.7纳克/毫升亚硒酸钠）和过滤杀菌。 </li><li>通过用70％乙醇和干燥用纸巾喷洒消毒灌注腔和气泡阱。然而组装MTCS（图1D），最初没有灌注腔。放置在支架上的泡沫陷阱。使用蠕动滚子泵具有易于装载泵头。 <ol><li>使用硅管使（见图1D）的贮存器（50毫升管）和泵，泵和气泡阱，所述气泡收集器和储存器之间的连接。使培养箱足够长内的管道，以允许介质达到平衡气体与气体在通过气体可渗透的硅管（1米）和培养箱尽可能短外管培养箱。 </li></ol></li><li>填充50ml管中，用70％的乙醇，开启泵（流速约1毫升/分钟，以允许适当的循环），并让乙醇CIRculate 30分钟进行消毒所有管道。通过清空贮存器和泵出从系统中的乙醇除去乙醇。 </li><li>填充50ml管中，用无菌蒸馏水，开启泵和让水循环30分钟，以除掉剩余的乙醇。通过清空容器和从系统中抽出的水除去水。 </li><li>填充50毫升管45毫升培养基，将支架在孵化器。开启泵（约1毫升/分钟流速）和分发介质填满所有管道，除去所有气泡，并允许介质相适应的气体组合物在孵化器至少1小时。保持培养箱中的标准组织培养条件下（5％CO 2和37℃）。确保没有气泡存在于管中。 </li></ol> 2.隔离小鼠心脏的<ol><li>注入鼠标500单位肝素。这将防止血液凝固和允许移除的Blood从心脏。 10分钟后，麻醉小鼠的感应室使用精密汽化器4％异氟烷。麻醉是足够的，当鼠标不响应脚趾捏。 </li><li>传输鼠标到夹层板和连接到同轴电路面罩来维持麻醉。消毒鼠标用70％酒精的皮毛。用剪刀打开腹腔，以暴露腔静脉和隔膜。 </li><li>暴露心脏，使开始从最后到第一肋外侧切口，反映胸廓过老鼠的头部。停止麻醉鼠标没有呼吸了。观察心脏的跳动。 </li><li>插入21G针连接到一个5毫升注射器含有无菌蒂罗德缓冲到从腹部下腔静脉进入胸腔（通过隔膜）。确保血液可从针头插入腔静脉尾退出。灌注日Ë台氏缓冲轻轻恒压进入腔静脉，直到心脏部分失去了它的红色。注：心脏跳动仍然允许去除血液从心脏。 </li><li>替换与连接到一个5毫升注射器含有无菌KCl溶液的21G针的针。轻轻灌注KCl溶液放入腔静脉，直到心脏停止跳动，取出针。注意：KCl溶液保留心脏处于松弛舒张阶段，这将允许灌注针更容易地插入冠状动脉系统和灌注。 </li><li>略使用弯钳解除心脏和用剪刀解剖心脏不受周围的组织，但留下的动脉和静脉的近端到心脏的完整和附连到心脏。在心脏转移到15毫升管含冰冷的PBS辅以抗生素/抗真菌剂（A / A）。存储在冰冷的PBS的心脏长达3小时。 </li></ol> 3. Cannulation中的小鼠心脏中灌注腔<ol><li>请在层流罩的所有程序。从15ml试管转移离体心脏到10cm培养皿，并添加PBS辅以A / A。 </li><li>在解剖显微镜下，使用微剪刀和镊子以除去所有非心脏组织，但保留在升主动脉，以至少与头臂动脉和肺静脉，2毫米近端心脏分叉。切断心脏顶点的尖端创造进入左心室腔内（通常为2毫米）。将灌注腔中的解剖显微镜下的流罩。 </li><li>附加一个5毫升注射器用培养基使用硅胶管插入针。填充灌注腔用20ml培养基并把心脏上的旋转台在灌注腔2的钝化针晶（ 图1）之间。调节旋转台的高度，使心脏的定位在前面针。 </li></ol> 4.结扎用于培养的二尖瓣（参见图1） <ol><li>结扎用缝合（丝7.0）主动脉。结扎左心耳与缝合。插入针（NR 1中图1）通过肺静脉进入左心房，并与缝合线近端结扎到其在左心房入口。确保针头不太远进入左心房，因为这会损害二尖瓣。 </li><li>插入针（nr.2 于图1）与直线运动到左心室。从灌注腔转移介质到50ml管。密封针与生物相容性胶心肌。 </li><li>之后胶水已干，小心地连接介质填充注射器针头nr.1，并检查是否有泄漏注入介质插入心脏。确保从针nr.2最后剩余的血液灌注出来的心脏该介质退出。 </li></ol> 5.李gation用于培养的主动脉瓣（见图1） <ol><li>插入在主动脉针（nr.1 在图1中），并结扎用缝合。确保针头不太远进入主动脉，因为这会损害主动脉瓣。插入针（nr.2 于图1）与直线运动到左心室。从灌注腔转移介质到50ml管。密封针与生物相容性胶心肌。 </li><li>之后胶水已干，小心地连接介质填充注射器针头nr.2，并检查是否有泄漏注入介质插入心脏。确保从针nr.1最后剩余的血液灌注出来的心脏该介质退出。 </li></ol> 6.将灌注腔上立场<ol><li>填补了灌注腔与传输介质20毫升将垫片和盖子上腔和拧紧垫圈和螺丝。 </li><li>从incuba取下组装MTCS器。附加灌注腔上的立场。连接管（参见图1D）。将立在培养箱（5％CO 2和37℃）。将管线连接到泵上。打开与约600μl/ min的流速泵。 </li><li>确保在储存和/或气泡阱介质的级别允许流的存在下的可视化由落入传入介质滴。培养后，心脏被从系统中移除，固定和处理以用于组织学检查。 </li></ol>

<ol>
	<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2013).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+Cellular+Response+Feedback+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).</li><li>Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrioventricular+valve+development+during+late+embryonic+and+postnatal+stages+involves+condensation+and+extracellular+matrix+remodeling.">Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling.</a> Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+valves+and+valvular+pathology:+update+on+function,+disease,+repair,+and+replacement.">Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement.</a> Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).</li><li>Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+mechanobiology+of+aortic+valve+inflammation+and+calcification.">Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification.</a> International journal of inflammation. , 263870 (2011).</li><li>Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+Aortic+Heart+Valve.">Mechanobiology of the Aortic Heart Valve.</a> The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).</li><li>Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+study+of+the+biological+properties+of+porcine+aortic+valves+in+response+to+circumferential+cyclic+stretch.">An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch.</a> Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).</li><li>Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+analysis+of+dynamic+deformation+characteristics+of+native+aortic+valve+leaflets.">Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets.</a> Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).</li><li>Combs, M. D., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development:+Regulatory+networks+in+development+and+disease.">Heart valve development: Regulatory networks in development and disease.</a> Circulation Research. 105, 408-421 (2009).</li><li>Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+and+BMP+signaling+in+cardiac+cushion+formation:+lessons+from+mice+and+chicken.">TGF&#946; and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).</li><li>Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+miniature+tissue+culture+system+to+culture+mouse+heart+valves.">Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves.</a> Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

在培养该心脏小鼠阀关键步骤包括使来自鼠标切除心脏的和结扎在灌注腔尽可能短，以确保在垂直于阀的可行性的针和结扎之间的时间，以确保流动的正确方向。此外，检查在灌注腔结扎后的流量不中确保适当的插入和针结扎。关键是要保持无菌培养和防止气泡在油管，这有可能被困在心脏阻碍的流动。 用于心脏的灌注介质的总体积是45毫升（注意，即通过心脏灌注介质是不...

心脏瓣膜疾病是发病率和死亡率在西方世界的一个主要原因;其患病率随着年龄的增加，它会影响人口75年的10％以上和更老1。心脏的全身性部分的阀门，主动脉和二尖瓣，大多是受影响的。心脏瓣膜病的特征是所述阀的高度组织的结构，这导致的机械性能2变更的损失。结构完整性，因此对阀的功能是至关重要的。 所述瓣膜的瓣叶被包括瓣膜间质细胞（VIC），瓣膜内皮细胞（VEC），和细胞外基质，这是高度组织在一个分层图案3,4的。所述的VIC负责对ECM合成，降解和组织。因素从血液，内皮细胞发出或居住在编排上其功能的VIC的ECM行为。此外，机械力造成层流或振荡剪切应力，影响的VIC 5的行为压缩或拉伸应力在心动周期中作用于单张。 为了理解如何在阀的结构被调整，首先必须理解的VIC到心脏周期期间所经历的刺激的多样化如何作出反应。 在体外研究已经非常翔实有关瓣膜细胞的特征和能力。这些细胞在体外的反应，但是，可能不总是精确地模仿体内响应6;例如，VIC的对刺激的响应是依赖于内皮的存在和ECM 组合物5。此外，瓣膜细胞对刺激的响应取决于其特定的位置，在小叶7。除了生化刺激，瓣膜细胞的行为是通过作用Ø机械力确定n个阀 8。阀的各区域进行其自己的特定的一组血液动力学应力。尽管目前的体外模型表明，机械力的作用是瓣膜结构 5的重要决定因素，相关的机制仍不清楚。虽然体内模型提供了深入了解潜在的心脏瓣膜发展9,10的分子机制，见解成人瓣膜生物学仍然是难以捉摸的。 因此，开发了离体的流动的模型，其中该心脏瓣膜可以在其在心脏中自然位置的时间11长时间进行培养。这具有的优点是，阀保持在其天然构型和的VIC经历相同的环境作为体内，使得的VIC响应的刺激尽可能自然。此外，阀门在其自然位置在心脏的文化有利于使各瓣膜区域相关的血液动力学应力。在此体外模型，也就是说，微型组织培养系统（MTCS），所述阀可进行不同的生物化学和血液动力学刺激允许其在心脏瓣膜重塑作用的调查。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>life technolgies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>life technolgies</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>life technolgies</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>life technolgies</td>
			<td>15240-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk 7-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>768G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>LEO</td>
			<td>012866-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td>
			<td>Tedpella</td>
			<td>1346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8060-0020</td>
			<td>I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing for pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96400-13</td>
			<td>I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocompatible glue (Histoacryl)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision vaporizer</td>
			<td>Dr&#228;ger</td>
			<td>Vapor 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic roller pump</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7521-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-load pump head</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Lieber et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see Lieber et al., 2010</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mouse cardiac valves in the miniature tissue culture system

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure. 
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive. 
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

主动脉瓣（图2）或二尖瓣11可以是培养至少3天。通过在打开位置（其代表主动脉瓣和二尖瓣舒张位置收缩位置）培养，瓣膜细胞保持存活。无细胞死亡被观察为由于缺少TUNEL阳性细胞 （图2H，I）或裂解的caspase-3表达的测定（未示出和Lieber等人，2010 11）。胶原分布（如可视化通过马森三色染色）类似于天然条件时在1％血清?...

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Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

在小型组织培养体系培养老鼠心脏瓣膜

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

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