This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות LUMC של ועדת האתיקה מחקר בבעלי החיים. 1. הכנה של מכשירים, תרבות בינונית, וMTCS הערה: בצע את כל ההכנות בזרימה למינרית. תא זלוף MTCS, מלכודת הבועה והעמדה מתוארות בליבר et al., 2010 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את המלקחיים ומספריים מיקרו עם 70% אתנול. הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם הצפת (130 מ&quot;מ NaCl של Tyrode סטרילי, 5.4 מ&quot;מ KCl, 6.0 מ&quot;מ Hepes, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, 1.2 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 20 מ&quot;מ גלוקוז, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7.2). הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם פתרון סטרילי KCl (100 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 65 מיליליטר של מדיום ללב: DMEM בתוספת 10% עגל סרום עוברי, אנטיביוטיקה / antimycotic (/; פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם, ו0.25 UG של amphotericin B / מיליליטר), אינסולין-Transferrin-סלניום (ITS; 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5.5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 6.7 ng / הסלניום נתרן מיליליטר) ולסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את תא זלוף ומלכודת בועה על ידי ריסוס עם אתנול 70% ויבשים עם מגבת נייר. להרכיב את MTCS (1D איור), עם זאת, בתחילה בלי תא זלוף. מקם את מלכודת הבועה על הדוכן. השתמש במשאבת הרים פריסטלטיים ראשי משאבה קל עומס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצינורות סיליקון ליצור קשרים בין המאגר (שפופרת 50 מיליליטר) והמשאבה, המשאבה ומלכודת הבועה, בועת המלכודת והמאגר (ראה איור 1D). הפוך את צינורות בתוך האינקובטור ארוך מספיק כדי לאפשר בינוני להגיע לשיווי משקל גז עם הגז בחממה דרך צינורות הגז החדירים סיליקון (1 מ &#39;) והצינורות מחוץ לחממה הקצרה ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור 50 מיליליטר עם 70% אתנול, להפעיל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה כדי לאפשר זרימה תקינה) ולתת CIR אתנולculate למשך 30 דקות כדי לעקר את כל צינורות. הסר את אתנול על ידי ריקון המאגר והשאיבה החוצה אתנול מהמערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים סטריליים, להפעיל את המשאבה ולתת לזרום המים למשך 30 דקות להיפטר נותר אתנול. הסר את המים על ידי ריקון המאגר ושאיבה החוצה את המים מהמערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של מדיום, לשים את הדוכן בחממה. הפעל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה) ולהפיץ את המדיום כדי למלא את כל צינורות, להסיר את כל בועות האוויר ולאפשר בינוניים להסתגל לרכב הגז בחממה במשך שעה לפחות 1. לשמור על החממה בתנאים סטנדרטיים רקמות תרבות (5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס). ודא שאין בועות נמצאות בצינור. </li></ol> 2. בידוד של לב העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את העכבר עם 500 יחידות של הפרין. זה ימנע את קרישת הדם ומאפשר את הסרת באת מזון מהלב. לאחר 10 דקות, להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם isoflurane 4% באמצעות אידוי דיוק. ההרדמה היא מספיק כאשר העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר ללוח לנתיחה ולשמור על הרדמה באמצעות facemask מחובר למעגל קואקסיאליים. לחטא את הפרווה של העכבר עם אלכוהול 70%. בעזרת מספריים לפתוח את חלל הבטן לחשוף את הווריד הנבוב והסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשוף את הלב, לעשות חתכים רוחב החל מהאחרונות לצלעות הראשונות ומשקפים את כלוב בית החזה מעל ראשו של העכבר. לעצור את ההרדמה כעכבר לא נושם יותר. שים לב לפעימות הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל המאגר של Tyrode סטרילי לתוך הווריד הנבוב הנחות מהבטן לתוך חלל בית החזה (דרך סרעפת). ודא שהדם יכול לצאת מזנב הווריד הנבוב מהחדרת המחט. Perfuse ההמאגר של הדואר Tyrode בעדינות ועם לחץ מתמיד לווריד הנבוב עד הלב מאבד חלקו הצבע האדום שלו. הערה: הלב נשאר להכות מאפשר הסרת הדם מהלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המחט עם מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל פתרון KCl סטרילי. בעדינות perfuse פתרון KCl לתוך הווריד הנבוב עד הלב מפסיק לפעום ולהסיר את המחט. הערה: פתרון KCl משמר את הלב בשלב הדיאסטולי רגוע, שיאפשר כניסה קלה יותר של מחטי זלוף וטפטוף של מערכת הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעט להרים את הלב באמצעות מלקחיים מעוקלים ומספריים באמצעות לנתח את הלב חופשי מרקמות אך להשאיר עורקים וורידים הפרוקסימלי ללב שלם ומחובר ללב. העבר את הלב לצינור 15 מיליליטר מכיל PBS קר כקרח בתוספת (/) אנטיביוטי / antimycotic. אחסן את הלב בPBS קר כקרח עד 3 שעות. </li></ol> 3. Cannulation של לבבות העכבר בתא זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל ההליכים בזרימה למינרית. העבר את הלב מבודד מצינור 15 מיליליטר לצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולהוסיף PBS בתוספת /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במספריים ומלקחי מיקרו כדי להסיר את כל הרקמה הלא-הלב אלא לשמר את אב העורקים עולים לפחות ההסתעפות עם עורק brachiocephalic והוורידים הריאה, הפרוקסימלי 2 מ&quot;מ ללב. חותך את קצה הקודקוד של הלב כדי ליצור גישה ללום החדר השמאלי (בדרך כלל 2 מ&quot;מ). מניחים את חדר זלוף בזרימת מכסה המנוע תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק 5 מיליליטר עם מדיום למחט הכנס באמצעות צינורות סיליקון. למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר בינוני ולשים לב על הבמה הסיבוב בין 2 המחטים קהות בתא זלוף (איור 1). התאם את הגובה של שלב הרוטציה כך הלב ממוקם מולמחטים. </li></ol> 4. קשירת לCulturing שסתום צניפי (ראה איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את אב העורקים עם תפר (משי 7.0). לקשור את תוספת פרוזדורי שמאל עם תפר. הכנס את המחט (NR. 1 באיור 1) דרך עורק הריאה לפרוזדור השמאלי ולקשור עם הפרוקסימלי תפר לכניסתה בפרוזדור השמאלי. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאטריום השמאל כמו זה יפגע בשסתום צניפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.1 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.2 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב. </li></ol> 5. ליgation לCulturing שסתום אבי העורקים (ראה איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט (nr.1 באיור 1) באב העורקים ולקשור עם תפר. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאב העורקים כזה יפגע בשסתום אב העורקים. הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.2 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.1 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב. </li></ol> 6. מקום זלוף הלשכה במעמד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר הועבר בינוני. הנח אטם ומכסה על החדר ולהדק עם מכונת כביסה וברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את MTCS הורכב מאינקובטוריםטור. צרף את תא זלוף על הדוכן. חבר את צינורות (ראה איור 1D). הנח את העמדה בחממה (5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס). חבר את הצינור למשאבה. הפעל את המשאבה עם מהירות זרימה כ -600 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי במאגר ו / או מלכודת בועת רמת בינונית מאפשרת חזותי של הנוכחות של הזרימה על ידי הנפילה של הטיפות בינוניות הנכנסות. אחרי התרבות, הלב יוסר מהמערכת, קבוע ומעובד לבדיקה היסטולוגית. </li></ol>

<ol>
	<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2013).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+Cellular+Response+Feedback+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).</li><li>Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrioventricular+valve+development+during+late+embryonic+and+postnatal+stages+involves+condensation+and+extracellular+matrix+remodeling.">Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling.</a> Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+valves+and+valvular+pathology:+update+on+function,+disease,+repair,+and+replacement.">Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement.</a> Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).</li><li>Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+and+mechanobiology+of+aortic+valve+inflammation+and+calcification.">Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification.</a> International journal of inflammation. , 263870 (2011).</li><li>Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+Aortic+Heart+Valve.">Mechanobiology of the Aortic Heart Valve.</a> The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).</li><li>Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+study+of+the+biological+properties+of+porcine+aortic+valves+in+response+to+circumferential+cyclic+stretch.">An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch.</a> Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).</li><li>Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+analysis+of+dynamic+deformation+characteristics+of+native+aortic+valve+leaflets.">Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets.</a> Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).</li><li>Combs, M. D., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development:+Regulatory+networks+in+development+and+disease.">Heart valve development: Regulatory networks in development and disease.</a> Circulation Research. 105, 408-421 (2009).</li><li>Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+and+BMP+signaling+in+cardiac+cushion+formation:+lessons+from+mice+and+chicken.">TGF&#946; and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).</li><li>Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+miniature+tissue+culture+system+to+culture+mouse+heart+valves.">Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves.</a> Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

שלבים קריטיים בculturing שסתומי לב העכבר כוללים ביצוע הזמן בין הכריתה של הלב מהעכבר והקשירה בתא זלוף הקצר ככל האפשר על מנת להבטיח יכולת קיום וקשירה של המחטים בניצב לשסתומים כדי להבטיח כיוון נכון של הזרימה . בנוסף, בדיקת הזרימה לאחר קשירה בתא זלוף ללא בינוני מבטיחה הכנסה ו...

מחלה שסתום לב היא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בעולם המערבי; שכיחותה עולה עם גיל, וזה משפיע על יותר מ -10% מאוכלוסיית השנים 75 ומעלה 1. שסתומים של החלק המערכתי של הלב, שסתומים אב העורקים וצניפי, הם בעיקר מושפעים. מחלה שסתום לב מאופיינת באובדן של המבנה מאורגן של השסתומים, שתוצאתה השינוי של התכונות מכאניות 2. השלמות המבנית ולכן קריטית לתפקוד של השסתום. העלונים של השסתום מורכבים מתאים מסתמית ביניים (ויק), תאי האנדותל מסתמית (VEC), ומטריקס, המאורגן בתבנית שכבות 3,4. VICS אחראי לסינתזת ECM, השפלה והארגון. גורמים הנובעים ממחזור הדם, ECS או מתגוררים במעשה ECM על VICS מנצח את תפקידו. בנוסף,כוחות מכאניים לפעול בעלון במהלך מחזור הלב וכתוצאה מכך למינרית או מאמץ הגזירה oscillatory, לחצי דחיסה או מתיחה המשפיעים על ההתנהגות של VICS 5. על מנת להבין כיצד המבנה של השסתום מוסדר, זה חייב להיות ראשון הבין איך VICS להגיב לקבוצה המגוונת של גירויים חוו במהלך מחזור הלב. מחקרים במבחנה היו מאוד אינפורמטיבי על המאפיינים והיכולות של התאים מסתמית. התגובה של תאים אלה במבחנה, עם זאת, לא תמיד בצורה מדויקת לחקות את התגובה בvivo 6; לדוגמא, התגובה של ויק לגירויים תלויה בנוכחות של ECs והרכב ECM 5. יתר על כן, התגובה של התאים מסתמית לגירויים תלויה במיקומם הספציפי בעלון 7. בנוסף לגירויים ביוכימי, ההתנהגות של התאים מסתמית נקבעה על ידי כוחות מכאניים הפועלים on השסתום 8. כל אזור של השסתום הוא נתון לסדרה הספציפית משלו של לחצים המודינמית. למרות שהמודלים הנוכחיים vivo לשעבר הראו כי כוחות מכאניים הם גורמים חשובים של מבנה מסתמים 5, המנגנונים הקשורים עדיין אינם ברורים. בעוד מודלים in vivo סיפקו תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח מסתמים 9,10, תובנות ביולוגיה מסתמית מבוגרת עדיין חמקמקות. לכן, vivo לשעבר זרימת מודל פותח באשר יכולים להיות מתורבת שסתומי לב בעמדה הטבעית שלהם בלב לתקופה ממושכת של זמן 11. זה היתרון שהסתומים להישאר בתצורה הטבעית שלהם וVICS לחוות את אותה הסביבה כמו בvivo, מה שהופך את התגובות לגירויים VICS טבעיים ככל האפשר. בנוסף, התרבות של השסתומים בעמדה הטבעית שלהם בלב מאפשרת להעמיד את כלאזור מסתמית ללחצים המודינמית הרלוונטיים. במודל זה vivo לשעבר, כלומר, מערכת תרבות רקמות זעירה (MTCS), יכולה להיות נתונה סתומה לגירויים ביוכימיים והמודינמית שונים המאפשרים החקירה של תפקידם בשיפוץ שסתום לב.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-06</td><td></td></tr><tr><td>Silk 7-0</td><td>Ethicon</td><td>768G</td><td></td></tr><tr><td>100 mm culture dish</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>BD</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Thermo Scientific</td><td>8060-0020</td><td>I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm</td></tr><tr><td>Silicon tubing for pump</td><td>Masterflex</td><td>96400-13</td><td>I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm</td></tr><tr><td>Biocompatible glue (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050071</td><td></td></tr><tr><td>precision vaporizer</td><td>Dr&amp;auml;ger</td><td>Vapor 200</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic roller pump</td><td>Masterflex</td><td>7521-35</td><td></td></tr><tr><td>Easy-load pump head</td><td>Masterflex</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td></td><td></td><td>see Lieber &lt;i&gt;et al.,&lt;/i&gt; 2010</td></tr><tr><td>Bubble trap</td><td></td><td></td><td>see Lieber &lt;i&gt;et al.,&lt;/i&gt; 2010</td></tr></tbody></table>

culturing mouse cardiac valves in the miniature tissue culture system

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure. 
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive. 
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

שסתום אב העורקים (איור 2) או צניפי 11 שסתום יכול להיות מתורבת לפחות 3 ימים. על ידי culturing במצב הפתוח (המייצג את העמדה הסיסטולי לשסתום אב העורקים ואת המיקום הדיאסטולי לשסתום צניפי), תאים מסתמית להישאר קיימא. לא מוות של תאים הוא ציין, כפי שנקבע על ידי בהעדר תאי ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System at JoVE.com

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Culturing עכבר לב שסתומים במערכת תרבות רקמות זעירה

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

culturing-mouse-cardiac-valves-in-the-miniature-tissue-culture-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K Views.  Leiden University Medical Center. Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Video: Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed results. However, the cellular and molecular mechanisms of the neotissue development, valve thickening, and stenosis development are not researched extensively. To answer the above questions, we developed a murine heterotopic heart valve transplantation model. A heart valve was harvested from a valve donor mouse and transplanted to a heart donor mouse. The heart with a new valve was transplanted heterotopically to a recipient mouse. The transplanted heart showed its own heartbeat, independent of the recipient&#8217;s heartbeat. The blood flow was quantified using a high frequency ultrasound system with a pulsed wave Doppler. The flow through the implanted pulmonary valve showed forward flow with minimal regurgitation and the peak flow was close to 100 mm/sec. This murine model of heart valve transplantation is highly versatile, so it can be modified and adapted to provide different hemodynamic environments and/or can be used with various transgenic mice to study neotissue development in a tissue engineered heart valve.

In order to understand the cellular and molecular mechanisms underlying neotissue formation and stenosis development in tissue engineered heart valves, a murine model of heterotopic heart valve transplantation was developed. A pulmonary heart valve was transplanted to recipient using the heterotopic heart transplantation technique.

השתלה של הריאה Valve שימוש במודל עכבר של Heterotopic לב והשתלות

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Medicine

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Biology

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects in these vessels represent severe health risks such as in atherosclerosis, which can lead to myocardial infarctions and heart failures in patients. Consequently, coronary artery disease is one of the leading causes of death worldwide. Despite its clinical importance, relatively little progress has been made on how to regenerate damaged coronary arteries. Nevertheless, recent progress has been made in understanding the cellular origin and differentiation pathways of coronary vessel development. The advent of tools and technologies that allow researchers to fluorescently label progenitor cells, follow their fate, and visualize progenies in vivo have been instrumental in understanding coronary vessel development. In vivo studies are valuable, but have limitations in terms of speed, accessibility, and flexibility in experimental design. Alternatively, accurate in vitro models of coronary angiogenesis can circumvent these limitations and allow researchers to interrogate important biological questions with speed and flexibility. The lack of appropriate in vitro model systems may have hindered the progress in understanding the cellular and molecular mechanisms of coronary vessel growth. Here, we describe an in vitro culture system to grow coronary vessels from the sinus venosus (SV) and endocardium (Endo), the two progenitor tissues from which many of the coronary vessels arise. We also confirmed that the cultures accurately recapitulate some of the known in vivo mechanisms. For instance, we show that the angiogenic sprouts in culture from SV downregulate COUP-TFII expression similar to what is observed in vivo. In addition, we show that VEGF-A, a well-known angiogenic factor in vivo, robustly stimulates angiogenesis from both the SV and Endo cultures. Collectively, we have devised an accurate in vitro culture model to study coronary angiogenesis.

In vitro models of coronary angiogenesis can be utilized for the discovery of the cellular and molecular mechanisms of coronary angiogenesis. In vitro explant cultures of sinus venosus and endocardium tissues show robust growth in response to VEGF-A and display a similar pattern of COUP-TFII expression as in vivo.

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Calcification Assay to Measure Calcium Concentration in Aortic Valve Interstitial Cells

Source: Bouchareb, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62419">Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro.</a>&#160; J. Vis. Exp. &#160;(2021).
This video demonstrates an assay technique for assessing the calcification of the aortic valve interstitial cells in vitro. The assay helps to quantify the calcium concentration using the arsenazo III reagent, a calcium-sensitive dye that reacts with calcium ions to form a purple-colored calcium-arsenazo complex.

בדיקת הסתיידות למדידת ריכוז הסידן בתאים אינטרסטיציאליים של מסתם אבי העורקים

Source: Bouchareb, R. et al., Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro.&#160; J. Vis. Exp. ...

Culturing עכבר לב שסתומים במערכת תרבות רקמות זעירה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video