啮齿动物疟原虫无性、性血期和蚊子阶段的类状分析

由于啮齿动物疟疾寄生虫的生命周期和生物学惊人的相似性，人类疟疾寄生虫、啮齿动物疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的模式。这些标准方法可以帮助回答疟疾研究领域中关于如何对野生类型和转基因啮齿动物疟疾物种进行表型分析的关键问题。演示程序将是研究生戈兹德德韦奇和伊尔克努尔耶尔马兹从我的实验室。

首先快速解冻冷冻保存的冷冻寄生虫，并立即使用配备26量针的1毫升注射器，每基因型至少注射两只供体小鼠，并注射约200微升的库存。注射24小时后，使用24或26测针刺第一只小鼠的尾巴，并在显微镜滑梯上收集血滴。使用另一张幻灯片的短边快速涂抹第一张幻灯片上的血液。

当血液完全干燥后，将幻灯片固定为100%甲醇至少一分钟。将固定样品在 Giemsa 中染色 10 至 15 分钟，然后进行单或双蒸馏水洗涤。当幻灯片干燥后，在 100 倍的物目下查看样品，并在光学显微镜上浸入油，以计算每个网格受感染的红细胞总数。

感染后两到三天，保护麻醉小鼠，其中寄生虫已经达到0.1至1%之间的upine位置，并使用钳子抬起胸骨底部附近的皮肤，以促进皮肤切口的产生。将切口部位的皮肤拉开，露出隔膜和腹腔顶部，并使用钳子握住肋骨的基座，同时穿过隔膜进入胸腔。将肋骨固定回，以暴露心脏，并使用含有至少 20 微升肝素的一毫升注射器，并配备 26 量针轻轻刺穿心脏组织。

慢慢收回柱塞，收集大约一毫升的血液，将血液分配到微离心管中。当所有血液都收获后，在红色热灯下加热受助小鼠，并加载一个胰岛素注射器，每个接受者配备27个量表针，并携带适当剂量的寄生虫。然后将第一个接受者放入抑制器中，将全剂量的受感染红细胞注射到扩张的尾静脉中。

对于蚊子喂养，允许成年的4至7天大雌性阿诺尔菲斯·斯蒂芬西或阿甘尼蚊子饿死8至12小时，以补充15分钟，以麻醉感染的小鼠，其排泄率最高。为了确定每只蚊子的卵石数量，在冰箱里对20至30只蚊子实施安乐死不少于10分钟，并使用双目解剖范围和两根26或27针解剖含有适当解剖溶液的玻璃幻灯片上的蚊子中游。要解剖中腹，首先用一根针将腹部的下部握到位，然后小心地将胸部轻轻推入腹部和胸部之间的交叉处，直至将胸部分开，从胸部向下晃来晃去一个白色中腹。

现在，用用来将胸部向上推的相同针头从食道端切开中肠，从而分离并分散中肠。用针头从解剖介质中抬起解剖的中缝，将其转移到装满200微升RPMI的管子上。当所有中古体被解剖和收获后，将含有中古的管子放入离心机中一分钟，以700倍的g。

然后用刺擦研磨收获的纸巾两次。将稀释组织溶液的12微升转移到一个血液计，并在室温下孵育血液计5分钟，使内装物沉淀。然后在相位对比度和 40 倍放大率下，确定光学显微镜上卵母细胞的平均数量。

为了确定每只蚊子唾液腺孢子虫的数量，在喂养后的适当时间点，如证明，冷冻安乐死50至100只雌性蚊子，并使用解剖显微镜和26或27个量表针的侧面分离唾液腺。要解剖唾液腺，首先用一根针的斜面将上腹部或胸部握住，然后小心地轻轻推头，在头部和胸部之间的交界处向上推。推至头部小心地与胸部分离，而不会撕裂玻璃唾液腺。

使用短玻璃巴斯德移液器将解剖唾液腺从解剖介质中提升，并放入1.5毫升管中。当所有唾液腺被解剖和收获后，将含有腺体的管子放入离心机中，以700倍g的浓度进入离心机1分钟。用刺磨两次收获的组织。

然后确定唾液腺孢子虫的平均数量，如以前做。转基因记者疟疾寄生虫被设计成在强而有组织促进剂的控制之下表达EGFP，在血液阶段、尿素、阿诺菲斯·斯蒂芬西中古特和从阿诺菲利斯·斯蒂芬西雌性唾液腺中分离出的孢子体中表现出荧光信号。流细胞学寄生虫百分比值直接对应于通过监测Giemsa染色的薄血涂片获得的估计寄生虫百分比，证明证实了后一种定量方法的有效性。

此外，对不同无性阶段和性阶段的百分比的估计取决于红细胞的形态评估，而红细胞不能通过流细胞学进行评估。对感染内皮内与静脉注射途径的比较表明，与感染前四天的IV感染群体寄生虫百分比相比，IP感染群体寄生虫病百分比在统计学上显著下降，表明IV感染途径是疟疾寄生虫血期测定的定量更准确的途径。值得注意的是，苯甲苯酶治疗显著增加了多细胞的数量，从而增加了雄性游戏细胞形成的速度，进而增加了受精率和随后的所有蚊子阶段的数量。

对啮齿动物疟疾血期寄生虫及其传播媒介进行表型分析的标准化方法缺乏。这些方法将有助于提供标准化和简化的协议，研究这些病原体及其生命周期阶段。