A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori, i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Questi metodi standard possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla malaria su come eseguire un'analisi fenotipico di specie di malaria di roditori transgenici e di tipo selvatico. A dimostrare le procedure saranno gli studenti laureati Gozde Deveci e Ilknur Yilmaz del mio laboratorio.
Inizia scongelando rapidamente le scorte di parassiti congelati preservati dal criocono e usando immediatamente una siringa millilitro dotata di un ago calibro 26 per iniettare almeno due topi donatori per genotipo intraperitonealmente con circa 200 microlitri di magazzino. Ventiquattro ore dopo l'iniezione, utilizzare un ago calibro 24 o 26 per pungere la coda del primo topo e raccogliere la goccia di sangue su uno scivolo al microscopio. Utilizzare il bordo corto di un'altra diapositiva per spalmare rapidamente il sangue attraverso la prima diapositiva.
Quando il sangue si è completamente asciugato, fissare le diapositive in metanolo al 100% per almeno un minuto. Macchiare i campioni fissi a Giemsa per 10-15 minuti seguiti da un lavaggio dell'acqua distillato singolo o doppio. Quando le diapositive si sono asciugate, visualizzare i campioni sotto un obiettivo 100X e immersione dell'olio su un microscopio leggero per il conteggio del numero totale di eriociti infetti per griglia.
Da due a tre giorni dopo l'infezione, fissare un topo anestetizzato in cui la parasitemia ha raggiunto tra lo 0,1 e l'1% nella posizione supina e utilizzare le flessione per sollevare la pelle vicino alla base dello sterno per facilitare la creazione di un'incisione cutanea. Tirare la pelle a parte nel sito dell'incisione per esporre il diaframma e la parte superiore della cavità addominale e utilizzare le forcep per mantenere la base della gabbia toracica mentre si taglia il diaframma per entrare nella cavità toracica. Schienare la gabbia toracica per esporre il cuore e utilizzare una siringa millilitro contenente almeno 20 microlitri di eparina e dotata di un ago calibro 26 per forare delicatamente il tessuto cardiaco.
Ritrarre lentamente lo stantuffo per raccogliere circa un millilitro di sangue e erogare il sangue in un tubo di microcentrifugo. Una volta raccolto tutto il sangue, riscaldare i topi ricevente sotto una lampada di calore rossa e caricare una siringa per insulina dotata di un ago calibro 27 per ricevente con la dose appropriata di parassita. Quindi mettere il primo ricevente in un limitatore e iniettare una dose completa di etitrociti infetti in una vena di coda dilatata.
Per l'alimentazione delle zanzare, consentire alle zanzare anopheles stephensi o a.gambiae adulte di quattro o sette giorni affamate per otto-12 ore di nutrire più di 15 minuti su topi infetti anestetizzati con il più alto tasso di escflagellazione. Per determinare il numero di sporozoiti oocista per zanzara, eutanasiare da 20 a 30 zanzare nel congelatore per non meno di 10 minuti e utilizzare un mirino di dissezione binoculare e due aghi calibro 26 o 27 per sezionare i moscerini delle zanzare su uno scivolo di vetro contenente l'appropriata soluzione di dissezione. Per sezionare il midgut, prima tenere la parte inferiore dell'addome in posizione con un ago e spingere attentamente il torace molto leggermente alla giunzione tra l'addome e il torace in direzione verso l'alto fino a quando non separa il torace e un midgut di colore bianco viene esposto penzolando giù dal torace.
Ora taglia il midgut dall'estremità dell'esofago usando lo stesso ago che è stato usato per spingere il torace verso l'alto separando e diffondendo così il midgut. Sollevare il midgut sezionato dal mezzo di dissezione utilizzando un ago e trasferirlo in un tubo riempito con 200 microlitri di RPMI. Quando tutti i moscerini sono stati sezionati e raccolti, posizionare il tubo contenente i moscerini nella centrifuga per un minuto a 700 volte g.
Quindi macinare i tessuti raccolti con un pestello due volte. Trasferire 12 microlitri della soluzione tissutale diluita in un emacitometro e incubare l'emacitometro a temperatura ambiente per cinque minuti per consentire al contenuto di depositarsi. Quindi determinare il numero medio di sporozoiti oocista su un microscopio leggero in contrasto di fase e un ingrandimento 40X.
Per determinare il numero di sporozoiti della ghiandola salivare per zanzara, nel momento appropriato dopo l'alimentazione, congelare le zanzare femminili eutanasiate da 50 a 100 come dimostrato e utilizzare un microscopio sezionante e il lato di un ago calibro 26 o 27 per isolare le ghiandole salivari. Per sezionare le ghiandole salivari, tenere prima l'addome superiore o il torace in posizione con il lato smussato di un ago e spingere con attenzione la testa molto leggermente e molto brevi spinte alla giunzione tra la testa e il torace in direzione verso l'alto. Spingere fino a quando la testa è accuratamente separata dal torace senza strappare la ghiandola salivare vetrosa.
Utilizzare una pipetta Pasteur in vetro corto per sollevare la ghiandola salivare sezionata dal mezzo di dissezione e posizionarla in un tubo da 1,5 millilitri. Quando tutte le ghiandole salivari sono state sezionate e raccolte, posizionare il tubo contenente le ghiandole nella centrifuga per un minuto a 700 volte g. Macinare i tessuti raccolti con un pestello due volte.
Quindi determinare il numero medio di sporozoiti della ghiandola salivare come fatto in precedenza. I parassiti transgenici della malaria reporter progettati per esprimere l'EGFP sotto il controllo di un promotore forte e costitutivo mostrano il segnale di fluorescenza nelle fasi del sangue, negli oocineti, nei giovani ovociti sui moscerini di Anopheles stephensi e nelle sporozoiti isolate dalle ghiandole salivari delle femmine di Anopheles stephensi. I valori percentuali di parasitemia citometrica del flusso corrispondono direttamente alle percentuali stimate di parasitemia ottenute monitorando gli strisci di sangue sottile macchiati di Giemsa come dimostrato confermando la validità di quest'ultimo metodo di quantificazione.
Inoltre, la stima delle percentuali di ciascuno dei diversi stadi asessuati e sessuali dipende dalla valutazione morfologica degli erytrociti che non può essere valutata dalla citometria del flusso. Il confronto tra le vie di infezione intraperitoneali rispetto a quelle endovenose rivela una diminuzione statisticamente significativa della percentuale di parasitemia del gruppo infetto ip rispetto alla percentuale di parasitemia del gruppo infetto IV durante i primi quattro giorni di infezione dimostrando che la via IV dell'infezione è una via più quantitativamente accurata per i saggi con le fasi del sangue del parassita della malaria. Da notare, il trattamento con fenilidrazina aumenta significativamente il numero di gametociti che aumenta il tasso di formazione di gameti maschili che a sua volta aumenta il tasso di fecondazione e il numero di tutte le fasi successive delle zanzare.
C'è una scarsità di metodi standardizzati per l'analisi fenotipica dei parassiti dello stadio sanguigno della malaria dei roditori e la loro trasmissione al vettore di zanzara. Questi metodi aiuteranno a fornire protocolli standardizzati e semplificati per lo studio di questi agenti patogeni e delle loro fasi del ciclo di vita.
