설치류 말라리아 기생충의 수명 주기 및 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 인간 말라리아 기생충, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위한 필수불가결한 되었습니다. 이 표준 방법은 야생 모형 및 형질 전환기 설치류 말라리아 종의 표현적인 분석을 수행하는 방법에 관하여 말라리아 연구 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 고즈데 데베치와 일크누르 일마즈가 될 것입니다.
냉동 기생충 주식을 신속하게 해동하고 즉시 26 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를 사용하여 약 200 마이크로 리터의 재고를 가진 유전자형 내형 당 적어도 두 명의 기증자 마우스를 주입하십시오. 주입 후 24시간 후, 24 또는 26 게이지 바늘을 사용하여 첫 번째 마우스의 꼬리를 찌르고 현미경 슬라이드에서 혈액 방울을 수집합니다. 다른 슬라이드의 짧은 가장자리를 사용하여 첫 번째 슬라이드를 통해 혈액을 빠르게 얼룩지게합니다.
혈액이 완전히 건조되면 슬라이드를 100 % 메탄올로 1 분 이상 고정하십시오. Giemsa의 고정 샘플을 10~15분 간 염색한 다음 단일 또는 이중 증류수 세척을 합니다. 슬라이드가 건조되면 그리드당 감염된 적혈구의 총 수를 계산하기 위해 100X 목표 및 광 현미경에 오일 침지하에 샘플을 볼 수 있습니다.
감염 후 2~3일 후, 기생충증이 supine 위치에 0.1~1%에 도달한 마취 마우스를 확보하고 포셉을 사용하여 흉골 의 기저 부근에서 피부를 들어 올려 피부 절개 생성을 용이하게 한다. 절개 부위에 피부를 떼어 내어 복강의 다이어프램과 상부를 노출시키고 집게를 사용하여 흉막 구멍을 뚫고 다이어프램을 절단하는 동안 흉곽의 기저부위를 잡습니다. 흉곽을 다시 고정하여 심장을 드러내고 헤파린의 적어도 20 마이크로 리터를 함유하고 심장 조직에 구멍을 부드럽게 26 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를 사용합니다.
플런저를 천천히 철회하여 약 1밀리리터의 혈액을 수집하고 혈액을 미세 원심 분리튜브로 분배합니다. 모든 혈액이 수확되면, 적색 열램프 하에서 받는 쥐를 따뜻하게 하고 적절한 용량의 기생충을 받는 사람당 27 게이지 바늘을 장착한 인슐린 주사기를 적재한다. 그런 다음 첫 번째 수령인을 제지로 넣고 감염된 적혈구를 한 번 전체 투여량을 팽창된 꼬리 정맥에 주입합니다.
모기 먹이의 경우, 성인 4-7일 된 여성 Anopheles stephensi 또는 A.gambiae 모기가 8-12 시간 동안 굶어 마취 된 감염된 마우스에 적어도 15 분을 더 많이 먹도록 허용합니다. 모기 당 난모성 산포로조이트의 수를 결정하기 위해, 10 분 이상 냉동고에 20 ~30 모기를 안락사하고 적절한 해부 용액을 포함하는 유리 슬라이드에 모기의 중간 구트를 해부하는 쌍안경 해부 범위와 두 26 또는 27 게이지 바늘을 사용합니다. 미드구트를 해부하려면 먼저 복부의 하부부분을 하나의 바늘로 제자리에 고정하고 흉부와 흉부 사이의 접합에서 흉부와 흉부 사이의 접합을 매우 가볍게 밀어 두어 흉부와 흰색 색의 중간 구트가 흉부에서 매달려 노출됩니다.
이제 식도 끝에서 중구를 잘라 서 흉부를 위로 밀어 서 이렇게 분리 하 고 중간 구트를 확산 하는 데 사용 된 동일한 바늘을 사용 하 여. 바늘을 사용하여 해부 배지에서 해부 된 미드구트를 들어 올려 RPMI의 200 마이크로 리터로 채워진 튜브로 옮기십시오. 모든 미드구트가 해부되고 수확되면 중간구트가 들어있는 튜브를 700 배 g에서 1 분 동안 원심 분리기에 놓습니다.
그런 다음 수확한 조직을 두 번 의봉으로 갈아. 희석된 조직 용액12마이크로리터를 지체계로 옮기고, 체질이 정착할 수 있도록 5분간 실온에서 패키토미터를 배양한다. 그런 다음 위상 대비 하에 가벼운 현미경에 스포로조이트의 평균 수와 40배율을 결정한다.
모기 당 타액 선 증기의 수를 결정하기 위해, 적절한 시점에서 먹이 후 적절한 시점에서, 입증된 바와 같이 50~100개의 암컷 모기를 동결하고 26 또는 27 게이지 바늘의 면과 타액 땀샘을 분리한다. 침샘을 해부하려면 먼저 한쪽 바늘의 경사진 측면으로 상부 복부 또는 흉부를 제자리에 잡고 머리를 매우 가볍고 매우 짧게 밀어 머리와 흉부 사이의 접합을 위쪽 방향으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 머리가 유리 침샘을 찢지 않고 흉부에서 조심스럽게 분리 될 때까지 밀어 넣습니다.
짧은 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부 매체에서 해부된 침샘을 들어 올리고 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 모든 타액선이 해부되고 수확되면 땀샘이 들어있는 튜브를 700배 g에서 1분간 원심분리기에 넣습니다. 수확한 조직을 두 번 의봉으로 갈아.
그런 다음 이전에 수행 된 타액 선 스포로조이트의 평균 수를 결정합니다. 고생 기자 말라리아 기생충은 강하고 구성적인 발기인의 통제하에 EGFP를 표현하기 위하여 설계되었습니다 혈액 단계에서 형광 신호를 전시합니다, ookinetes, Anopheles stephensi midguts에 젊은 난모, 및 Anopheles stephensi 여성의 타액 땀샘에서 고립된 sporozoites에서. 유동 세포성 기생충 학%값은 후자의 정량화 방법의 유효성을 확인하는 것으로 기임사 염색 된 얇은 혈액 얼룩을 모니터링하여 얻은 추정 기생충 비율에 직접 대응한다.
또한, 상이한 무성 및 성적 단계의 각각의 백분율의 추정은 혈류 세포측정에 의해 평가될 수 없는 적혈구의 형태학적 평가에 달려 있다. 감염의 정맥 경로 대 복막 내의 비교는 감염의 IV 감염된 단 기생충 백분율에 비해 IP 감염된 단 기생충 비율에 있는 통계적으로 유의한 감소를 제시감염의 IV 경로는 말라리아 기생충 혈액 단계와 분석에 대한 보다 정량적으로 정확한 경로임을 입증하는 감염의 첫번째 4 일 동안. 참고로, 페닐히드라진 치료는 차례로 수정 속도와 모든 후속 모기 단계의 수를 증가 남성 gamete 형성의 속도를 증가 게임 토세포의 수를 증가시킨다.
설치류 말라리아 혈액 단계 기생충의 현상전분석과 모기 벡터로의 전송을 위한 표준화된 방법의 희소성이 있다. 이러한 방법은 이러한 병원체 및 수명 주기 단계를 연구하기 위한 표준화되고 단순화된 프로토콜을 제공하는 데 도움이 될 것입니다.
