Kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle insan sıtma parazitleri, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Bu standart yöntemler, sıtma araştırma alanında yabani tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotik analizinin nasıl yapılacağının cevaplayıcı sorularının yanıtlatına yardımcı olabilir. Prosedürleri gösteren yüksek lisans öğrencileri Gözde Deveci ve İlknur Yılmaz benim laboratuvarımdan gelecek.
Hızlı bir şekilde dondurulmuş parazit stokları korunmuş ve hemen bir mililitre şırınga 26 gauge iğne ile donatılmış kullanarak yaklaşık 200 mikrolitre stok ile genotip intraperitoneally başına en az iki donör fareler enjekte ederek başlayabilirsiniz. Enjeksiyondan 24 saat sonra, ilk farenin kuyruğunu iğnelemek ve mikroskop kaydırağında kan damlacıklarını toplamak için 24 veya 26 ölçü iğnesi kullanın. İlk slaytboyunca kanı hızlı bir şekilde bulaştırmak için başka bir kaydıranın kısa kenarını kullanın.
Kan tamamen kuruduğunda, en az bir dakika için% 100 metanol slaytlar düzeltmek. Giemsa'daki sabit numuneleri 10 ila 15 dakika boyunca lekeleyin ve ardından tek veya çift distile su yıkayın. Slaytlar kuruduğunda, numuneleri 100X nesnel ve sıvı başına toplam enfekte eritrosit sayısını saymak için hafif bir mikroskop üzerinde yağ daldırma altında görüntüleyin.
Enfeksiyondan 2-3 gün sonra, parazitin supine pozisyonunda %0,1 ila %1'e ulaştığı anestezili bir fareyi emniyete alın ve deri kesisinin oluşmasını kolaylaştırmak için göğüs kafesinin tabanına yakın bir deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Diyafram ve karın boşluğunun üst maruz bırakmak için kesi yerinde ayrı deri çekin ve göğüs kafesi tabanını tutmak için forceps kullanmak diyafram ilerlerken torasik kavite girmek için. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini geri sabitle ve en az 20 mikrolitre heparin içeren ve kalp dokusunu hafifçe delmek için 26 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırınga kullanın.
Yavaş yavaş yaklaşık bir mililitre kan toplamak ve bir mikrosantrifüj tüpü içine kan dağıtmak için piston geri çekmek. Tüm kan hasat edildiğinde, alıcı fareleri kırmızı ısı lambası altında ısıtın ve alıcı başına uygun dozda parazit le donatılmış bir insülin şırıngası yükleyin. Sonra bir kısıtlayıcı içine ilk alıcı yerleştirin ve genişlemiş bir kuyruk damar içine enfekte eritrositler tam bir doz enjekte.
Sivrisinek besleme için, yetişkin dört ila yedi günlük dişi Anopheles stephensi veya A.gambiae sivrisinekler en yüksek exflagellation oranı ile anestezi enfekte fareler üzerinde en az 15 dakika daha fazla beslemek için sekiz ila 12 saat için açlıktan izin verin. Sivrisinek başına ookist sporozoitlerin sayısını belirlemek için, en az 10 dakika için dondurucuda 20-30 sivrisinek ötenazi ve uygun diseksiyon çözümü içeren bir cam slayt üzerinde sivrisinek midguts incelemek için bir dürbün diseksiyonu kapsamı ve iki 26 veya 27 gauge iğne kullanın. Midgut'u incelemek için, önce bir iğne ile karın alt kısmını yerinde tutun ve toraksı yukarı yönde yukarı doğru hareket edene kadar çok hafifçe itin ve torakstan aşağı sarkan beyaz renkli bir midgut maruz kalana kadar.
Şimdi yemek borusu ucundan toraks yukarı itmek için kullanılan aynı iğne kullanarak midgut kesilmiş böylece ayıran ve midgut dışarı yayılıyor. Bir iğne kullanarak diseksiyon ortamından diseksiyon ortamından diseksiyon orta sını kaldırın ve 200 mikrolitre RPMI ile dolu bir tüpe aktarın. Tüm midgutlar parçalanıp hasat edildiğinde, midgutları içeren tüpü 700 kez g.0.00'da bir dakika lığına santrifüje yerleştirin.
Sonra bir haşere ile hasat dokuları iki kez eziyet. Seyreltilmiş doku çözeltisinin 12 mikrolitresini hemacytometreye aktarın ve içindekilerin yerleşmesini sağlamak için hemacytometreyi oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra faz kontrastı ve 40X büyütme altında bir ışık mikroskop üzerinde ookist sporozoitlerin ortalama sayısını belirlemek.
Sivrisinek başına tükürük bezi sporozoitlerin sayısını belirlemek için, uygun zaman noktası besleme sonrası, gösterildiği gibi 50-100 kadın sivrisinek dondurun ve bir diseksiyon mikroskop ve tükürük bezleri izole etmek için bir 26 veya 27 gauge iğne yan kullanın. Tükürük bezlerini incelemek için, önce üst karın veya toraksbir bir iğnenin eğimli tarafı ile yerinde tutun ve dikkatle baş ve toraks arasındaki kavşakta çok hafif ve çok kısa iter yukarı yönde baş iter. Kafa dikkatle camsı tükürük bezi yırtılmadan göğüs kafesi ayrılır kadar itin.
Diseksiyon ortamından diseksiyon tükürük bezi yükseltmek ve 1.5 mililitrelik tüp içine yerleştirmek için kısa bir cam Pasteur pipet kullanın. Tüm tükürük bezleri incelenmiş ve hasat edildiğinde, 700 kez g bir dakika için santrifüj içine bezleri içeren tüp yerleştirin. Hasat edilen dokuları bir haşere ile iki kez öğütün.
Daha sonra daha önce yapıldığı gibi tükürük bezi sporozoitlerin ortalama sayısını belirleyin. Transgenik muhabir sıtma parazitleri güçlü ve kurucu bir organizatör kontrolü altında EGFP ifade etmek için tasarlanmış kan aşamalarında floresan sinyali sergilemek, ookinetes, Anopheles stephensi midguts genç ookistler, ve sporozoitler Anopheles stephensi kadın tükürük bezleri izole. Akış sitometri paraziti yüzdesi değerleri, giemsa lekeli ince kan yaymalarının izlenmesiyle elde edilen tahmini paraziti yüzdelerine doğrudan karşılık gelir ve ikinci niceleme yönteminin geçerliliğini doğrular.
Buna ek olarak, farklı eşeysiz ve cinsel aşamaların her birinin yüzdelerinin tahmini, akış sitometrisi ile değerlendirilemeyen eritrositlerin morfolojik değerlendirmesine bağlıdır. İntraperitoneal ile intravenöz enfeksiyon yollarının karşılaştırılması, enfeksiyonun ilk dört gününde IV enfekte grup paraziti yüzdesine göre IP enfekte grup paraziti yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır ve bu da enfeksiyonun IV rotasının sıtma parazitkan evreleri ile tahliller için daha niceliksel olarak doğru bir yol olduğunu göstermektedir. Dikkat dikkat, fenilhidrazin tedavisi önemli ölçüde erkek gamet oluşumu oranını artırır gametosit sayısını artırır hangi sırayla döllenme oranı ve sonraki tüm sivrisinek aşamalarının sayısını artırır.
Kemirgen sıtma kan evresi parazitlerinin fenotipik analizi ve sivrisinek vektörüne bulaşması için standart laştırılmış yöntemlerin azlığı vardır. Bu yöntemler, bu patojenlerin ve yaşam döngüsü aşamalarının incelenmesi için standartlaştırılmış ve basitleştirilmiş protokollerin sağlanmasına yardımcı olacaktır.
