Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia dos parasitas da malária de roedores, os parasitas da malária humana, os modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Esses métodos padrão podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa da malária sobre como realizar uma análise fenotípica de espécies de malária de roedores selvagens e transgênicos. Demonstrando os procedimentos serão os estudantes de pós-graduação Gozde Deveci e Ilknur Yilmaz do meu laboratório.
Comece descongelando rapidamente os estoques de parasitas congelados preservados criotonete e imediatamente usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 para injetar pelo menos dois ratos doadores por genótipo intraperitoneal com aproximadamente 200 microliters de estoque. Vinte e quatro horas após a injeção, use uma agulha calibre 24 ou 26 para picar a cauda do primeiro rato e coletar a gota de sangue em um slide de microscópio. Use a borda curta de outro slide para manchar rapidamente o sangue através do primeiro slide.
Quando o sangue estiver completamente seco, fixe os slides em 100% de metanol por pelo menos um minuto. Manche as amostras fixas em Giemsa por 10 a 15 minutos, seguidas de uma única ou dupla lavagem de água destilada. Quando os slides secarem, veja as amostras sob um objetivo de 100X e imersão em óleo em um microscópio leve para contar o número total de eritrócitos infectados por grade.
Dois a três dias após a infecção, proteja um camundongo anestesiado no qual a parasitamia atingiu entre 0,1 a 1% na posição supina e usar fórceps para levantar a pele perto da base do esterno para facilitar a criação de uma incisão cutânea. Retire a pele no local da incisão para expor o diafragma e o topo da cavidade abdominal e use os fórceps para segurar a base da caixa torácica enquanto corta o diafragma para entrar na cavidade torácica. Fixar a caixa torácica para expor o coração e usar uma seringa de um mililitro contendo pelo menos 20 microliters de heparina e equipado com uma agulha calibre 26 para perfurar suavemente o tecido cardíaco.
Retraia lentamente o êmbolo para coletar aproximadamente um mililitro de sangue e distribuir o sangue em um tubo de microcentrifuuge. Quando todo o sangue tiver sido colhido, aqueça os camundongos receptores sob uma lâmpada de calor vermelha e carregue uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 27 por receptor com a dose apropriada de parasita. Em seguida, coloque o primeiro receptor em um contidor e injete uma dose completa de eritrócitos infectados em uma veia traseira dilatada.
Para a alimentação de mosquitos, permita que os mosquitos anopheles stephensi ou A.gambiae adultos de quatro a sete dias de idade esfomeados por oito a 12 horas se alimentem mais de pelo menos 15 minutos em camundongos infectados anestesiados com a maior taxa de exflagellação. Para determinar o número de esporozoitas oocistos por mosquito, eutanize 20 a 30 mosquitos no congelador por não menos que 10 minutos e use um escopo de dissecção binóculo e duas agulhas de calibre 26 ou 27 para dissecar os meios-galos de mosquitos em uma lâmina de vidro contendo a solução de dissecção apropriada. Para dissecar o midgut, primeiro segure a parte inferior do abdômen no lugar com uma agulha e empurre cuidadosamente o tórax muito levemente na junção entre o abdômen e o tórax em uma direção ascendente até que separe o tórax e uma midgut de cor branca seja exposta pendurada no tórax.
Agora corte o midgut da extremidade do esôfago usando a mesma agulha que foi usada para empurrar o tórax para cima, separando-se e espalhando o midgut. Levante o midgut dissecado do meio de dissecação usando uma agulha e transfira-o para um tubo cheio de 200 microliters de RPMI. Quando todos os midguts tiverem sido dissecados e colhidos, coloque o tubo contendo os meio-galos na centrífuga por um minuto a 700 vezes g.
Em seguida, triture os tecidos colhidos com um pilão duas vezes. Transfira 12 microlitadores da solução de tecido diluído para um hemacitómetro e incuba o hemacytómetro à temperatura ambiente por cinco minutos para permitir que o conteúdo se instale. Em seguida, determine o número médio de esporozoitas oocistos em um microscópio leve sob contraste de fase e uma ampliação de 40X.
Para determinar o número de esporozoites da glândula salivar por mosquito, no ponto de tempo apropriado pós alimentação, congele eutanásia de 50 a 100 mosquitos fêmeas como demonstrado e use um microscópio dissecando e o lado de uma agulha calibre 26 ou 27 para isolar as glândulas salivares. Para dissecar as glândulas salivares, primeiro segure o abdômen superior ou o tórax no lugar com o lado chanfrado de uma agulha e empurre cuidadosamente a cabeça muito levemente e muito curta na junção entre a cabeça e o tórax em uma direção ascendente. Empurre até que a cabeça seja cuidadosamente separada do tórax sem rasgar a glândula salivar vidraça.
Use uma pipeta pasteur de vidro curto para levantar a glândula salivar dissecada do meio de dissecção e colocá-la em um tubo de 1,5 mililitro. Quando todas as glândulas salivares tiverem sido dissecadas e colhidas, coloque o tubo contendo as glândulas na centrífuga por um minuto a 700 vezes g. Triture os tecidos colhidos com um pilão duas vezes.
Em seguida, determine o número médio de esporozoites da glândula salivar como feito anteriormente. Parasitas transgênicos da malária projetados para expressar egfp sob o controle de um promotor forte e constitutivo exibem o sinal de fluorescência em estágios sanguíneos, ookinetes, oócitos jovens em Âpheles stephensi midguts, e em esporozoitas isolados das glândulas salivares de anopheles stephensi fêmeas. Os valores percentuais de parasitamia da citometria de fluxo correspondem diretamente aos percentuais estimados de parasitamia obtidos pelo monitoramento de manchas de sangue finas manchadas de Giemsa, como demonstrado confirmando a validade do último método de quantificação.
Além disso, a estimativa dos percentuais de cada um dos diferentes estágios assexuados e sexuais depende da avaliação morfológica dos eritrócitos que não podem ser avaliados por citometria de fluxo. A comparação das rotas intraperitoneais versus intravenosas de infecção revela uma diminuição estatisticamente significativa no percentual de parasitamia do grupo infectado pelo IP em comparação com o percentual de parasitas do grupo IV infectado durante os primeiros quatro dias de infecção demonstrando que a rota IV de infecção é uma rota mais quantitativamente precisa para ensaios com os estágios sanguíneos do parasita da malária. Note-se que o tratamento com fenilhidrazina aumenta significativamente o número de gametócitos, o que aumenta a taxa de formação de gametas masculinos, o que, por sua vez, aumenta a taxa de fertilização e o número de todas as etapas subsequentes do mosquito.
Há escassez de métodos padronizados para a análise fenotípica dos parasitas do estágio sanguíneo da malária de roedores e sua transmissão ao vetor do mosquito. Esses métodos ajudarão a fornecer protocolos padronizados e simplificados para estudar esses patógenos e suas fases de ciclo de vida.
