ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

בשל הדמיון המדהים של מחזור החיים והביולוגיה של טפילי מלריה מכרסמים, טפילי המלריה האנושית, מודלים מלריה מכרסמים הפכו חיוניים למחקר מלריה. שיטות סטנדרטיות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחקר המלריה על איך לבצע ניתוח פנוטיפי של סוג הבר ומינים מהופנטים מלריה מכרסמים. הדגמת ההליכים תהיה סטודנטים לתארים מתקדמים גד דבסי ואילקנור ילמז מהמעבדה שלי.

התחל על ידי הפשרה מהירה cryo נשמר מלאי טפיל קפוא ומיד באמצעות מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 26 מד להזריק לפחות שני עכברים תורמים לכל גנוטיפ intraperitoneally עם כ 200 microliters של מלאי. עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה, להשתמש במחט 24 או 26 מד כדי לדקור את הזנב של העכבר הראשון ולאסוף את טיפת הדם על מגלשת מיקרוסקופ. השתמש בקצה הקצר של שקופית אחרת כדי למרוח במהירות את הדם לאורך השקופית הראשונה.

כאשר הדם התייבש לחלוטין, לתקן את השקופיות ב 100% מתנול לפחות דקה אחת. הכתם את הדגימות הקבועות בגימסה במשך 10 עד 15 דקות ולאחר מכן לשטוף מים מזוקקים בודדים או כפולים. כאשר השקופיות התייבשו, להציג את הדגימות תחת מטרה 100X וטבילת שמן על מיקרוסקופ אור לספירת המספר הכולל של אריתרוקיטים נגועים לכל רשת.

יומיים עד שלושה ימים לאחר הזיהום, לאבטח עכבר הרדמה שבו הטפיל הגיע בין 0.1 ל 1% בתמורת סופין ולהשתמש מדפים כדי להרים את העור ליד הבסיס של עצם החזה כדי להקל על יצירת חתך בעור. משוך את העור לגזרים באתר החתך כדי לחשוף את הסרעפת ואת החלק העליון של חלל הבטן ולהשתמש במקלות להחזיק את הבסיס של בית החזה תוך חיתוך דרך הסרעפת כדי להיכנס לחלל בית החזה. הצמד בחזרה את בית החזה כדי לחשוף את הלב ולהשתמש מזרק מיליליטר אחד המכיל לפחות 20 microliters של הפרין מצויד מחט 26 מד בעדינות לנקב את רקמת הלב.

לאט לאט לסגת הבוכנה כדי לאסוף כמיליליטר של דם ולחלק את הדם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. כאשר כל הדם נקצר, לחמם את העכברים המטופל תחת מנורת חום אדומה לטעון מזרק אינסולין אחד מצויד מחט 27 מד לכל הנמען עם המינון המתאים של טפיל. ואז למקם את הנמען הראשון לתוך מרסן ולהזריק מנה אחת מלאה של אריתרוסיטים נגועים לתוך וריד זנב הפוך.

להאכלת יתושים, אפשרו למבוגרת בת ארבעה עד שבעה ימים, נקבה Anopheles stephensi או A.gambiae יתושים מורעבים במשך שמונה עד 12 שעות כדי להאכיל יותר 15 דקות לפחות על עכברים נגועים בהרדמה עם שיעור האקספלציה הגבוה ביותר. כדי לקבוע את מספר sporozoites oocyst לכל יתוש, המתת דם 20 עד 30 יתושים במקפיא במשך לא פחות מ 10 דקות ולהשתמש בהיקף ניתוח משקפת ושני 26 או 27 מחטי מד לנתח את midguts של יתושים על מגלשת זכוכית המכילה את פתרון הניתוח המתאים. כדי לנתח את midgut, תחילה להחזיק את החלק התחתון של הבטן במקום עם מחט אחת בזהירות לדחוף את בית החזה בקלילות רבה בצומת בין הבטן לבית החזה בכיוון כלפי מעלה עד שהוא מפריד את בית החזה ואת midgut בצבע לבן חשוף מתנדנד למטה מבית החזה.

עכשיו לחתוך את midgut מקצה הוושט באמצעות אותה מחט ששימשה לדחוף את בית החזה כלפי מעלה ובכך להפריד ולהפיץ את midgut. הרם את מידגוט נותק מן מדיום הניתוח באמצעות מחט ולהעביר אותו לצינור מלא 200 microliters של RPMI. כאשר כל האמצע נותחו ונקצרו, מניחים את הצינור המכיל את האמצע לתוך הצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 700 פעמים g.

ואז לטחון את הרקמות שנקטפו עם עלה פעמיים. מעבירים 12 מיקרוליטרים של תסנובת הרקמה המדולדללת להמיציטומטר ומדגרים את המציטומטר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי לאפשר לתכולת להתיישב. לאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע של sporozoites oocyst על מיקרוסקופ אור תחת ניגודיות פאזה והגדלה 40X.

כדי לקבוע את מספר sporozoites בלוטת הרוק לכל יתוש, בנקודת הזמן המתאימה לאחר האכלה, להקפיא המתת חום 50 עד 100 יתושים נקבה כפי שהוכח ולהשתמש מיקרוסקופ ניתוח ואת הצד של מחט 26 או 27 מד כדי לבודד את בלוטות הרוק. כדי לנתח בלוטות הרוק, תחילה להחזיק את הבטן העליונה או בית החזה במקום עם הצד משופע של מחט אחת בזהירות לדחוף את הראש בקלילות רבה מאוד קצר דוחף בצומת בין הראש לבית החזה בכיוון כלפי מעלה. לדחוף עד הראש מופרד בזהירות מבית החזה מבלי לקרוע את בלוטת הרוק מזכוכית.

השתמש פיפטה פסטר זכוכית קצרה כדי להעלות את בלוטת הרוק נותק מן מדיום הניתוח ולמקום אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר. כאשר כל בלוטות הרוק נותחו ונקצרו, מניחים את הצינור המכיל את הבלוטות לתוך הצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 700 פעמים g. טוחנים את הרקמות שנקטפו עם עלה פעמיים.

לאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע של ספורוזואיטים בלוטת הרוק כפי שנעשה בעבר. טפילי מלריה מהונדסים שהונדסו לבטא EGFP תחת שליטתו של מקדם חזק ומכונן מפגינים את אות הפלואורסצנטיות בשלבי דם, ookinetes, oocysts צעירים על אנדופלס סטיבנסי midguts, וב ספורוזואיטים מבודדים מבלוטות הרוק של נקבות אנופלס סטיבנסי. ערכי אחוזי הטפילים של ציטומטריית זרימה תואמים ישירות לאחוזים המשוערים של טפילים המתקבלים על ידי ניטור כתמי דם דקים מוכתמים בגימסה כפי שהוכח המאשרים את תוקפה של שיטת הכימות האחרונה.

בנוסף, הערכת האחוזים של כל אחד מהשלבים הא-מיניים והמיניים השונים תלויה בהערכה המורפולוגית של אריתרוציטים שלא ניתן להעריך על ידי ציטומטריית זרימה. השוואה בין מסלולי ההדבקה האינטר-פרטיים לעומת תוך ורשתיים מגלה ירידה מובהקת סטטיסטית באחוז הטפילים הקבוצתיים הנגועים ב- IP בהשוואה לאחוז הטפילים הקבוצתיים הנגועים בעירוי במהלך ארבעת הימים הראשונים של ההדבקה, מה שמוכיח כי נתיב הזיהום הרביעי הוא מסלול מדויק יותר מבחינה כמותית עבור בדיקות עם שלבי הדם של טפיל המלריה. שים לב, טיפול phenylhydrazine מגדיל באופן משמעותי את מספר gametocytes אשר מגביר את קצב היווצרות gamete זכר אשר בתורו מגביר את קצב ההפריה ואת מספר כל שלבי היתוש הבאים.

יש מחסור בשיטות סטנדרטיות לניתוח פנוטיפי של טפילי שלב הדם של מלריה מכרסמים והעברתם לווקטור היתושים. שיטות אלה יסייעו לספק פרוטוקולים סטנדרטיים ומפושטים לחקר פתוגנים אלה ושלבי מחזור החיים שלהם.