Благодаря поразительному сходств жизненного цикла и биологии паразитов малярии грызунов, паразитов малярии человека, модели малярии грызунов стали незаменимыми для исследований малярии. Эти стандартные методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований малярии о том, как провести фенотипический анализ дикого типа и трансгенных видов малярии грызунов. Демонстрацией процедур будут аспиранты Гозде Девечи и Илькнур Ильмаз из моей лаборатории.
Начните с быстрого оттаивания крио сохранились замороженные запасы паразитов и сразу же с помощью одного миллилитров шприца оснащен 26 калибровочных иглы для введения по крайней мере двух мышей-доноров на генотип интреперитонально с примерно 200 микролитров запасов. Двадцать четыре часа после инъекции, использовать 24 или 26 калибровочных иглы колоть хвост первой мыши и собирать капли крови на слайде микроскопа. Используйте короткий край другого слайда, чтобы быстро мазок крови через первый слайд.
Когда кровь полностью высохла, исправить слайды в 100% метанол, по крайней мере одну минуту. Пятно фиксированных образцов в Giemsa в течение 10 до 15 минут, а затем один или двойной дистиллированной воды мыть. Когда слайды высохли, просмотрите образцы под целью 100X и погружение масла на световой микроскоп для подсчета общего числа инфицированных эритроцитов на сетку.
Через два-три дня после заражения, обеспечить анестезированую мышь, в которой паразитмия достигла от 0,1 до 1% в положении на спине и использовать щипца, чтобы поднять кожу у основания грудины, чтобы облегчить создание разреза кожи. Потяните кожу друг от друга в месте разреза, чтобы разоблачить диафрагму и верхнюю часть брюшной полости и использовать типсы, чтобы удерживать основание грудной клетки при резке через диафрагму, чтобы войти в грудную полость. Прикрепите грудную клетку, чтобы разоблачить сердце и использовать один миллилитровый шприц, содержащий по крайней мере 20 микролитров гепарина и оснащенный иглой 26 калибра, чтобы мягко проколать сердечную ткань.
Медленно втягивать поршень, чтобы собрать примерно один миллилитр крови и распределить кровь в микроцентрифуг трубки. Когда вся кровь была собрана, тепло получателя мышей под красной тепловой лампы и загрузить один инсулин шприц оснащен 27 калибровочных иглы на получателя с соответствующей дозой паразита. Затем поместите первого реципиента в устоятель и ввимите одну полную дозу инфицированных эритроцитов в расширенную хвостовую вену.
Для кормления комарами, позвольте взрослым от четырех до семи дней самки Anopheles stephensi или A.gambiae комаров голодали в течение восьми до 12 часов, чтобы кормить больше по крайней мере 15 минут на анестезировал инфицированных мышей с самым высоким уровнем эксфлагеляции. Чтобы определить количество споозоитов на комара, усыпить от 20 до 30 комаров в морозильной камере в течение не менее 10 минут и использовать бинокль области вскрытия и два 26 или 27 калибровочных игл для вскрытия midguts комаров на стеклянной слайд, содержащий соответствующее решение вскрытия. Чтобы вскрыть мидгут, сначала удерживайте нижнюю часть живота на месте одной иглой и осторожно толкайте грудную клетку очень легко на стыке живота и грудной клетки в восходящем направлении, пока она не отделит грудную клетку и белый цветной мидгут подвергается свисающие вниз от грудной клетки.
Теперь вырезать мидгут из пищевода конца с помощью той же иглы, которая была использована, чтобы подтолкнуть грудную клетку вверх, таким образом, отделяя и распространяя midgut. Поднимите расчлененный мидгут из среды вскрытия с помощью иглы и перенесите его в трубку, наполненную 200 микролитров RPMI. Когда все midguts были вскрыты и собраны, поместите трубку, содержащую midguts в центрифугу в течение одной минуты в 700 раз г.
Затем измельчить собранные ткани с пестиком два раза. Перенесите 12 микролитров раствора разбавленной ткани на гемацитометр и инкубировать гемацитометр при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы содержимое улягораться. Затем определите среднее количество спорозоитов oocyst на световом микроскопе под фазовой контрастстью и увеличением на 40X.
Чтобы определить количество слюнных желез sporozoites на комара, в нужное время точки после кормления, заморозить усыпленных 50 до 100 самок комаров, как попродемонстрировано, и использовать рассечение микроскопа и стороны 26 или 27 калибровочных игл для изоляции слюнных желез. Чтобы вскрыть слюнные железы, сначала удерживайте верхнюю часть живота или грудную клетку на месте с скошенной стороной одной иглы и осторожно толкайте голову очень легко и очень короткими толчками на стыке головы и грудной клетки в восходящем направлении. Нажмите, пока голова тщательно отделена от грудной клетки, не разрывая стеклянную слюнную железу.
Используйте короткую стеклянную пипетку Pasteur, чтобы поднять вскрытую слюнную железу из среды вскрытия и поместить ее в 1,5 миллилитровую трубку. Когда все слюнные железы были вскрыты и собраны, поместите трубку, содержащую железы в центрифугу в течение одной минуты при 700 раз г. Измельчить собранные ткани с пестиком два раза.
Затем определите среднее количество спорозоитов слюнной железы, как это было сделано ранее. Трансгенные репортер малярийных паразитов инженерии, чтобы выразить EGFP под контролем сильного и составного промоутера экспонат флуоресценции сигнала в стадиях крови, ookinetes, молодые oocysts на Anopheles stephensi midguts, и в sporozoites изолированы от слюнных желез Anopheles stephensi женщин. Процентные значения цитометрии цитометрии напрямую соответствуют расчетным процентам паразитами, полученным путем мониторинга окрашенных тонкокровных мазков Гимсы, что подтверждает действительность последнего метода количественной оценки.
Кроме того, оценка процентной доли каждой из различных бесполых и половых стадий зависит от морфологической оценки эритроцитов, которые не могут быть оценены по цитометрии потока. Сравнение внутриперитонеальных и внутривенных маршрутов инфекции показывает статистически значимое снижение доли инфицированных ИС паразитов по сравнению с IV инфицированным групповым паразитом в течение первых четырех дней инфекции, демонстрируя, что IV маршрут инфекции является более количественно точным маршрутом для анализа стадий крови малярийного паразита. Следует отметить, что лечение фенилгидразином значительно увеличивает количество геготоцитов, что увеличивает скорость образования мужского гигота, что, в свою очередь, увеличивает скорость оплодотворения и количество всех последующих стадий комаров.
Существует нехватка стандартизированных методов фенотипического анализа паразитов стадии развития малярии грызунов и их передачи переносчику комаров. Эти методы помогут обеспечить стандартизированные и упрощенные протоколы для изучения этих патогенов и этапов их жизненного цикла.
