这个实验的总体目标是以简单而有效的方式识别鼻癌和嗅觉神经母细胞瘤的有用分子标记。该方法有助于回答嗅觉神经母细胞瘤和鼻癌领域关键问题，如分子标记物的鉴定，以区分肿瘤亚型。这种技术的主要优点是，我们可以在不到六小时，或在一天内获得医院报告的结果。
演示RNA提取和实时PCR的过程将是乔吉亚·米利凡蒂博士，一个博士生从我的实验室。展示免疫石化学程序的将是乔瓦尼·米切洛尼，也是我实验室的博士生。根据世卫组织对头颈部肿瘤的分类，开始该程序，收集所有人类FFPE样本并分成不同的子组。
加热样品在60摄氏度的烤箱中滑动30分钟。接下来，用二甲苯短暂清洗3微米厚的FFPE部分，再补充水分10分钟。然后，在 100%95%85%和 75%酒精连续洗涤幻灯片五分钟。
用蒸馏水冲洗滑梯五分钟。随后，将滑梯放入3%水性过氧化氢中放置12分钟，以阻止内源活性。之后，使用10毫摩尔柠檬酸盐缓冲液处理幻灯片，并微摇10分钟，进行抗原检索。
10 分钟后，在 TBS 缓冲液中清洗部分。然后，加入3.2%的Triton X，并在4摄氏度下孵育，用山羊抗人OTX2抗体，以1比100的比例稀释。第二天，加入生物基化兔抗山羊二级抗体，在1至200稀释，并在室温下孵育一小时。
然后，用ABC过氧化物酶复合物处理样品。之后，利用四氢氯二甲苯进行免疫反应，用哈里斯赤氧树脂素对核进行反染色。然后，在新月酒精量表中脱水部分，并在涡轮来源的清除物质中澄清它们。
接下来，使用安装介质在幻灯片上安装部分。在RNA提取和逆转录后，使用基于探针的技术和热循环器进行定量实时PCR分析。使用基于探头的主混合的 12.5 微升、每个 OTX1、OTX2 和 ACTB 探头的 1.25 微升、50 纳米的 CDNA 和 25 微升的总体积无核酸水准备 PCR 反应组合。
使用ACTB基因作为内源性控制，以使基因表达水平正常化，执行三合体的所有反应。接下来，在1109倍重力下离心板三分钟。然后将保护板在四摄氏度下被光线储存，直到实验。
要执行实时 PCR，请将样品放在机器中。然后，将热循环器配置文件设置为初始热启动周期为 50 摄氏度，2 分钟，95 摄氏度为 10 分钟，然后在 95 摄氏度下设置 40 个循环，15 秒，最后循环在 60 摄氏度下运行 1 分钟。对于基因表达水平分析，利用ACTB基因作为内源性对照，通过比较周期阈值方法使基因表达水平正常化。
使用比较周期阈值法评估基因表达水平，并绘制结果。然后，使用学生的 t-test 进行统计分析，考虑与 p 的统计显著性结果
OTX1的核表达在所有非肠道型腺癌样本中发现，而在肠道型腺癌中，免疫反应性很少或缺乏。所有嗅觉神经母细胞瘤都存在强烈的免疫反应。在所有分化不良的神经内分泌癌中，OTX表达的强度和阳性细胞的百分比各不相同。
在尝试此程序时，重要的是要记住在无菌条件下使用无菌设备执行RNA提取的每一步。同时，还可以进行X射线分析、鼻腔内窥镜检查、CT扫描、磁共振成像、活检等方法，以确认本技术的结果。这项技术开发后，为肿瘤学领域的研究人员在细胞模型中探索这种疾病铺平了道路。
看完这段视频后，您应该对如何识别分子标记，使用免疫组织化学和实时PCR来区分肿瘤亚型有了很好的了解。不要忘记，使用这些试剂、仪器和样品可能非常危险，执行这些程序时应始终采取 DPI 等预防措施。
