L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di identificare in modo semplice ed efficiente marcatori molecolari utili per carcinomi sinonasali e neuroblastomi olfattivi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del neuroblastoma olfattivo e del carcinoma sinonasale, come l'identificazione di marcatori molecolari per discriminare il sottotipo tumorale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere risultati in meno di sei ore, o entro un giorno per il rapporto ospedaliero.
A dimostrare la procedura di estrazione dell'RNA e pcr in tempo reale sarà la Dott.ssa Giorgia Millefanti, dottoranda del mio laboratorio. E a dimostrare la procedura di immunoistochimica sarà Giovanni Micheloni, anche lui dottorando del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, raccogliere e dividere tutti i campioni umani di FFPE in diversi sottogruppi, secondo la classificazione OMS dei tumori alla testa e al collo.
Riscaldare i campioni scivola in un forno a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, reidratare le tre sezioni FFPE spesse tre micrometri lavandole brevemente in xilene per 10 minuti. Lavare quindi le diapositive in 100%95%85% e 75% alcol in serie per cinque minuti ogni lavaggio.
Risciacquare gli scivoli per cinque minuti in acqua distillata. Successivamente, bloccare l'attività endogena posizionando le diapositive in perossido di idrogeno acquoso al 3% per 12 minuti. Successivamente, eseguire il recupero dell'antigene trattando le diapositive con tampone di citrato millimolare e microwaving per 10 minuti.
Dopo 10 minuti, lavare le sezioni nel buffer TBS. Quindi, aggiungere lo 0,2% di Tritone X e incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius, con anticorpo OTX2 anti-umano capra, diluito con un rapporto da 1 a 100. Il giorno successivo, aggiungere anticorpo secondario anti-capra coniglio biotinilato, diluito a 1 a 200, e incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, trattare i campioni con il complesso abc perossidasi. Successivamente, sviluppare l'immunoreazione usando il tetraidrocloruro diaminobenzene e controbilanciare i nuclei con l'ematossilina di Harris. Quindi, disidratare le sezioni in una scala di alcol a mezzaluna e chiarirle in una sostanza di compensazione di origine turpina.
Quindi, montare le sezioni su una diapositiva con mezzo di montaggio. Dopo l'estrazione dell'RNA e la trascrizione inversa, eseguire analisi PCR quantitative in tempo reale con tecnologia basata su sonda e un ciclore termico. Preparare la miscela di reazione PCR utilizzando 12,5 microlitri di mix master a base di sonda, 1,25 microlitri di ogni sonda OTX1, OTX2 e ACTB, 50 nanogrammi di CDNA e acqua priva di nucleasi fino a 25 microlitri di volume totale.
Eseguire tutte le reazioni in triplice copia usando il gene ACTB come controllo endogeno per normalizzare i livelli di espressione genica. Quindi, centrifugare la piastra a 1109 volte la gravità per tre minuti. Quindi conservare la piastra protetta dalla luce a quattro gradi Celsius, fino all'esperimento.
Per eseguire pcr in tempo reale, posizionare i campioni nella macchina. Quindi, impostare il profilo del ciclore termico con un ciclo iniziale di inizio caldo a 50 gradi Celsius per due minuti e 95 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da 40 cicli a 95 gradi Celsius per 15 secondi e un ciclo finale a 60 gradi Celsius per un minuto. Per l'analisi del livello di espressione genica, normalizzare i livelli di espressione genica attraverso il metodo di soglia del ciclo comparativo usando il gene ACTB come controllo endogeno.
Valutare i livelli di espressione genica utilizzando il metodo della soglia del ciclo comparativo e tracciare i risultati. Quindi, eseguire analisi statistiche utilizzando il test t dello studente, considerando risultati statisticamente significativi con p
L'espressione nucleare per OTX1 è stata trovata in tutti i campioni di adenocarcinoma di tipo non intestinale, mentre l'immunoreattività scarsa o assente è stata evidenziata negli adenocarcinomi di tipo intestinale. L'immunoreattività intensa era presente in tutti i neuroblastomi olfattivi. Tra tutti i carcinomi neuro-endocrini scarsamente differenziati, l'espressione OTX variava per intensità e percentuale di cellule positive.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni singola fase dell'estrazione dell'RNA in condizioni sterili utilizzando anche attrezzature sterili. Parallelamente a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi a raggi X, l'esame endoscopico della cavità nasale, la TAC, la risonanza magnetica e la biopsia, al fine di confermare i risultati ottenuti dalla nostra tecnica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare questa malattia nei modelli cellulari.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i marcatori molecolari per discriminare i sottotipi tumorali usando l'immunoistochimica e la PCR in tempo reale. Non dimenticare che lavorare con questi reagenti, strumentazione e campioni può essere estremamente pericoloso e precauzioni come DPI devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
