الهدف العام لهذه التجربة هو تحديد العلامات الجزيئية المفيدة لسرطانات السنينا والأورم العصبية الشمية بطريقة بسيطة وفعالة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال الورم الأرومي العصبي الشمي وسرطان السنينا، مثل تحديد العلامات الجزيئية للتمييز بين النوع الفرعي للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن نحصل على نتيجة في أقل من ست ساعات، أو في غضون يوم واحد لتقرير المستشفى.
إثبات إجراء استخراج الحمض النووي الريبي وPCR في الوقت الحقيقي سيكون الدكتور جيورجيا Millefanti، طالب دكتوراه من مختبري. وإظهار إجراء الكيمياء المناعية سيكون جيوفاني ميشيلوني، وهو أيضا طالب دكتوراه من مختبري. للبدء في هذا الإجراء، جمع وتقسيم جميع العينات FFPE البشرية إلى مجموعات فرعية مختلفة، وفقا لتصنيف منظمة الصحة العالمية من أورام الرأس والرقبة.
سخني العينات في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اُعاد هيدرات أقسام FFPE الثلاثة سميكة ميكرومتر عن طريق غسلها لفترة وجيزة في إكسيلين لمدة 10 دقائق. ثم، غسل الشرائح في 100٪95٪85٪، و 75٪ الكحول تسلسليا لمدة خمس دقائق كل غسل.
شطف الشرائح لمدة خمس دقائق في الماء المقطر. في وقت لاحق، منع النشاط الداخلي عن طريق وضع الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين مائي 3٪لمدة 12 دقيقة. بعد ذلك، قم بإجراء استرجاع مستضد من خلال معالجة الشرائح بمخزن 10 ملليمولار للسيترات، وmicrowaving لمدة 10 دقائق.
بعد 10 دقائق، قم بغسل المقاطع في مخزن TBS المؤقت. ثم، إضافة 0.2٪ من تريتون X، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، مع الماعز المضادة للجسم OTX2 المضادة للإنسان، المخفف في نسبة 1 إلى 100. في اليوم التالي، إضافة الأجسام المضادة الأرانب المضادة للماعز المضادة الماعز الحيوية، مخففة في 1 إلى 200، واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم، علاج العينات مع مجمع ABC بيروكسيديز. بعد ذلك ، تطوير ردة فعل المناعة باستخدام ديامينوبينزين رباعي هيدروكلوريد ، ووصمة عار مضادة للنيوكلي مع هاريس هيماترولين. ثم، وتجفيف المقاطع في مقياس الكحول الهلال، وتوضيحها في مادة المقاصة من أصل turpine.
بعد ذلك، قم بتحميل المقاطع على شريحة مع متوسطة التركيب. بعد استخراج الحمض النووي الريبي والنسخ العكسي، تنفيذ التحليل الكمي PCR في الوقت الحقيقي مع التكنولوجيا المستندة إلى المسبار ودورة حرارية. إعداد مزيج تفاعل PCR باستخدام 12.5 ميكرولترات من المزيج الرئيسي القائم على المسبار، 1.25 ميكرولترات من كل OTX1، OTX2، والتحقيقات ACTB، 50 نانوغرام من CDNA، والمياه خالية من النوى تصل إلى 25 ميكرولترات من الحجم الإجمالي.
تنفيذ جميع ردود الفعل في ثلاثية باستخدام الجين ACTB كتحكم داخلي لتطبيع مستويات التعبير الجيني. بعد ذلك، الطرد المركزي لوحة في 1109 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق. ثم تخزين لوحة محمية من الضوء في أربع درجات مئوية، حتى التجربة.
لتنفيذ PCR في الوقت الحقيقي، ضع العينات في الجهاز. ثم، تعيين التشكيل الجانبي لدورة حرارية مع دورة بداية ساخنة أولية في 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين، و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ودورة نهائية في 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بالنسبة لتحليل مستوى التعبير الجيني، تطبيع مستويات التعبير الجيني من خلال طريقة عتبة الدورة المقارنة باستخدام جين ACTB كتحكم داخلي.
تقييم مستويات التعبير الجيني باستخدام طريقة عتبة الدورة المقارنة، و رسم النتائج. ثم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الطالب t اختبار ، والنظر في النتائج ذات دلالة إحصائية مع ع
تم العثور على التعبير النووي لOTX1 في جميع عينات الورم الغدي غير المعوي، في حين تم تسليط الضوء على القليل أو غياب النشاط المناعي في نوع الغدة المعوية. وكان النشاط المناعي الشديد موجود في جميع الأورام الأرومية العصبية الشمية. من بين جميع سرطانات الغدد الصماء العصبية المتمايزة، تباينت تعابير OTX في شدتها ونسبة الخلايا الإيجابية.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن أداء كل خطوة واحدة من استخراج الحمض النووي الريبي في ظروف معقمة باستخدام أيضا معدات معقمة. وبالتوازي مع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل الأشعة السينية، والفحص بالمنظار لتجويف الأنف، والمسح المقطعي، والتصوير بالرنين المغناطيسي، والخزعة، من أجل تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من تقنيتنا. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأورام لاستكشاف هذا المرض في نماذج الخلايا.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد العلامات الجزيئية للتمييز بين الأنواع الفرعية للورم باستخدام الكيمياء المناعية وPCR في الوقت الحقيقي. لا تنس أن العمل مع هذه الكواشف والأجهزة والعينات يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل DPI دائما عند تنفيذ هذه الإجراءات.
