이 실험의 전반적인 목표는 단순하고 효율적인 방법으로 부노나살 암종 및 후각 신경 모세포종에 대한 유용한 분자 마커를 식별하는 것입니다. 이 방법은 후각 신경 모세포종 및 부노나살 암종 의 분야에서 핵심 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 종양 아형을 차별하는 분자 마커의 식별과 같은. 이 기술의 주요 장점은 병원 보고를 위해 6 시간 미만 또는 하루 이내에 결과를 얻을 수 있다는 것입니다.
RNA 추출 및 실시간 PCR의 절차를 시연하는 것은 박사 Giorgia Millefanti, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 그리고 면역 히스토케의 절차를 보여주는 것은 조반니 미켈로니, 또한 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 절차를 시작하려면 머리와 목 종양의 WHO 분류에 따라 모든 인간 FFPE 샘플을 다른 하위 그룹으로 수집하고 나눕니다.
샘플 슬라이드를 섭씨 60도에서 30분간 가열합니다. 다음으로, 3 마이크로미터 두께의 FFPE 섹션을 10분 동안 자일렌으로 간략하게 세척하여 재수화합니다. 그런 다음 슬라이드를 100%95%85%와 75%의 알코올로 5분간 연속적으로 세척합니다.
증류수에서 5분간 슬라이드를 헹구십시오. 이어서, 12분 동안 3%의 수성 과산화수소에 슬라이드를 배치하여 내인성 활성을 차단한다. 그 후, 10 밀리머 구연산 완충제로 슬라이드를 처리하고 10 분 동안 마이크로 웨이브를 하여 항원 검색을 수행합니다.
10분 후 TBS 버퍼로 섹션을 세척합니다. 그런 다음 트리톤 X의 0.2 %를 추가하고 염소 항인간 OTX2 항체와 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하고 1 대 100 비율로 희석합니다. 다음 날, 1에서 200에 희석된 생체개래 토끼 방지 염소 이차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 섹션을 배양합니다.
그런 다음 샘플을 ABC peroxidase 복합체로 처리합니다. 그 후, 디아미노벤젠 테트라하이드로염화물을 사용하여 면역 반응을 개발하고, 해리스 헤마톡시린과 함께 핵을 염색한다. 그런 다음 초승달 알코올 척도에서 섹션을 탈수하고 turpine 기원의 클리어링 물질에서 명확히하십시오.
다음으로 마운트 미디엄이 있는 슬라이드에 섹션을 장착합니다. RNA 추출 및 역전사 후 프로브 기반 기술과 열 사이클러를 통해 정량적 실시간 PCR 분석을 수행합니다. 프로브 기반 마스터 믹스 12.5 마이크로리터, 각 OTX1, OTX2 및 ACTB 프로브의 1.25 마이크로리터, 50 나노그램의 CDNA 및 총 부피의 핵이 없는 물을 사용하여 PCR 반응 믹스를 준비합니다.
ACTB 유전자를 사용하여 유전자 발현 수준을 정상화하기 위한 내인성 대조군으로 삼중반응의 모든 반응을 수행한다. 다음으로, 3분 동안 1109배의 중력으로 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 실험까지 빛으로부터 보호된 판을 섭씨 4도에 보관합니다.
실시간 PCR을 수행하려면 샘플을 컴퓨터에 배치합니다. 그런 다음 초기 핫 스타트 사이클로 열 사이클러 프로파일을 2분 동안 50도, 섭씨 95도에서 10분 동안 설정하고, 15초 동안 섭씨 95도에서 40사이클, 1분간 60°C에서 최종 사이클을 설정합니다. 유전자 발현 수준 분석을 위해 ACTB 유전자를 내인성 대조군으로 사용하여 비교 주기 임계값 방법을 통해 유전자 발현 수준을 정상화한다.
비교 주기 임계값 방법을 사용하여 유전자 발현 수준을 평가하고 결과를 플롯합니다. 그런 다음, 학생의 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행, p와 통계적으로 유의 한 결과를 고려
OTX1에 대한 핵 발현은 모든 비장형 아데노암 샘플에서 발견되었으며, 면역 반응성은 장형 선암에서 거의 또는 결석한 것으로 강조되었다. 강렬한 면역 반응성은 모든 후각 신경 모세포종에 존재하였다. 모든 제대로 분화 된 신경 내 분 비 암 중, OTX 발현 강도와 긍정적인 세포의 비율에 변화.
이 절차를 시도하는 동안, 또한 멸균 장비를 사용하여 멸균 조건에서 RNA 추출의 모든 단일 단계를 수행하는 것이 중요하다. 이 절차와 병행하여, 엑스레이 분석, 비강 내시경 검사, CT 검사, 자기 공명 화상 진찰 및 생검과 같은 그밖 방법은, 우리의 기술에서 얻은 결과를 확인하기 위하여 수행될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 종양학 분야의 연구원들이 세포 모델에서이 질병을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.
이 비디오를 본 후에는 면역 히스토케스화학 및 실시간 PCR을 사용하여 종양 아류형을 차별하기 위해 분자 마커를 식별하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야 합니다. 이러한 시약, 계측 및 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이러한 절차를 수행할 때 DPI와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
