L’objectif global de cette expérience est d’identifier des marqueurs moléculaires utiles pour les carcinomes sinonasal et les neuroblastomes olfactifs d’une manière simple et efficace. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine du neuroblastome olfactif et du carcinome sinonasal, tels que l’identification des marqueurs moléculaires pour discriminer le sous-type de tumeur. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir un résultat en moins de six heures, ou dans la journée pour le rapport de l’hôpital.
Le Dr Giorgia Millefanti, doctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure d’extraction de l’ARN et de PCR en temps réel. Et la démonstration de la procédure d’immunohistochimie sera Giovanni Micheloni, également doctorant de mon laboratoire. Pour commencer la procédure, recueillir et diviser tous les échantillons humains ffpe en différents sous-groupes, selon la classification de l’OMS des tumeurs de la tête et du cou.
Chauffer les échantillons glisse dans un four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, réhydratez les trois sections ffpe micromètres d’épaisseur en les lavant brièvement au xylène pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les diapositives à 100%95%85% et 75% d’alcool en série pendant cinq minutes chaque lavage.
Rincer les diapositives pendant cinq minutes à l’eau distillée. Par la suite, bloquez l’activité endogène en plaçant les glissières dans du peroxyde d’hydrogène 3% aqueux pendant 12 minutes. Par la suite, effectuez la récupération des antigènes en traitant les diapositives avec un tampon de citrate de 10 millimolaires et en micro-ondes pendant 10 minutes.
Après 10 minutes, laver les sections dans le tampon du SCT. Ensuite, ajoutez 0,2% de Triton X, et incubez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius, avec l’anticorps OTX2 anti-humain de chèvre, dilué à un rapport de 1 à 100. Le lendemain, ajouter l’anticorps secondaire anti-chèvre biotinylated de lapin, dilué à 1 à 200, et incuber les sections pendant une heure à température ambiante.
Ensuite, traitez les échantillons avec le complexe de peroxydées ABC. Par la suite, développer l’immunoréaction à l’aide de tétrahydrochlorure diaminobenzène, et contre-tacher les noyaux avec l’hématoxyline de Harris. Puis, déshydrater les sections dans une échelle d’alcool croissant, et les clarifier dans une substance de compensation d’origine turpine.
Ensuite, montez les sections sur une diapositive avec support de montage. Après l’extraction de l’ARN et la transcription inverse, effectuez une analyse quantitative pcr en temps réel avec une technologie basée sur la sonde et un cycleur thermique. Préparez le mélange de réaction PCR à l’aide de 12,5 microlitres de mélange maître à base de sonde, de 1,25 microlitres de chaque sonde OTX1, OTX2 et ACTB, de 50 nanogrammes de CDNA et d’eau sans nucléase jusqu’à 25 microlitres de volume total.
Effectuez toutes les réactions en triplicate en utilisant le gène ACTB comme contrôle endogène pour normaliser les niveaux d’expression des gènes. Ensuite, centrifuger la plaque à 1109 fois la gravité pendant trois minutes. Rangez ensuite la plaque à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius, jusqu’à l’expérience.
Pour effectuer pcr en temps réel, placez les échantillons dans la machine. Ensuite, définissez le profil du cycliste thermique avec un premier cycle de démarrage à chaud à 50 degrés Celsius pendant deux minutes, et 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 40 cycles à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et d’un cycle final à 60 degrés Celsius pendant une minute. Pour l’analyse du niveau d’expression génétique, normalisez les niveaux d’expression génétique par la méthode du seuil de cycle comparatif en utilisant le gène ACTB comme contrôle endogène.
Évaluez les niveaux d’expression génétique à l’aide de la méthode du seuil de cycle comparatif et tracez les résultats. Ensuite, effectuez une analyse statistique à l’aide du t-test de l’élève, compte tenu des résultats statistiquement significatifs avec p
L’expression nucléaire pour OTX1 a été trouvée dans tous les échantillons non-intestinaux d’adénocarcinome de type, alors que peu ou l’immunoréactivité absente a été mise en évidence dans les adénocarcinomes de type intestinal. L’immunoréactivité intense était présente dans tous les neuroblastomas olfactifs. Parmi tous les carcinomes neuro-endocriniens mal différenciés, l’expression d’OTX a varié dans l’intensité et le pourcentage des cellules positives.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer chaque étape de l’extraction de l’ARN dans des conditions stériles en utilisant également un équipement stérile. Parallèlement à cette procédure, d’autres méthodes comme l’analyse des rayons X, l’examen endoscopique de la cavité nasale, la tomodensitométrie, l’imagerie par résonance magnétique et la biopsie, peuvent être effectuées afin de confirmer les résultats obtenus à partir de notre technique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’oncologie pour explorer cette maladie dans des modèles cellulaires.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les marqueurs moléculaires pour discriminer les sous-types tumoraux en utilisant l’immunohistochimie et pcr en temps réel. N’oubliez pas que travailler avec ces réamen, instrumentations et échantillons peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que DPI doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.
