Общая цель этого эксперимента заключается в выявлении полезных молекулярных маркеров для синоназаальных карцином и обонятельных нейробластом простым и эффективным способом. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области обонятельной нейробластомы и синоназаальной карциномы, такие как определение молекулярных маркеров для распознавания подтипа опухоли. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем получить результат менее чем за шесть часов, или в течение дня для отчета больницы.
Демонстрация процедуры извлечения РНК и ПЦР в режиме реального времени будет д-р Джорджия Millefanti, аспирант из моей лаборатории. А демонстрировать процедуру иммуногистохимии будет Джованни Микелони, также аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать процедуру, соберите и разделите все образцы FFPE человека на различные подгруппы, в соответствии с классификацией ВОЗ опухолей головы и шеи.
Нагрейте образцы слайдов в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Затем регидратировать три микрометра толщиной FFPE разделов, кратко мыть их в ксилена в течение 10 минут. Затем, мыть горки в 100%95%85%и 75% алкоголя последовательно в течение пяти минут каждой стирки.
Промыть горки в течение пяти минут в дистиллированной воде. Впоследствии блокируйте эндогенную активность, помещая слайды в перекись водорода на 3%aqueous в течение 12 минут. После этого выполните поиск антигена, обработать слайды 10 миллимоляонным буфером цитратов и микроволновой мюг в течение 10 минут.
Через 10 минут вымойте секции в буфере TBS. Затем добавьте 0,2% Triton X и инкубировать их на ночь при четырех градусах по Цельсию, с козой анти-человеческого OTX2 Антитела, разбавленные в соотношении 1 к 100. На следующий день добавьте биотинилированного кролика против козла вторичного антитела, разбавленного при температуре от 1 до 200, и инкубировать секции в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем обработать образцы с помощью комплекса ABC peroxidase. После этого, развивать иммунореакцию с использованием диаминобен тетрагидрохлорида, и счетчик пятно ядра с Харрис гематоксилин. Затем обезвоживать секции в шкале полумесяца алкоголя, и уточнить их в очистке вещества турпинового происхождения.
Затем смонтировать секции на слайде с монтажной средой. После извлечения РНК и обратной транскрипции, выполнить количественный анализ ПЦР в режиме реального времени с помощью технологии на основе зонда и теплового цикла. Подготовь смесь реакции ПЦР с помощью 12,5 микролитров зонда на основе мастер-микса, 1,25 микролитров каждого OTX1, OTX2 и ACTB зондов, 50 нанограммов CDNA и нуклеазной воды до 25 микролитров общего объема.
Выполните все реакции в тройном использовании гена ACTB в качестве эндогенного контроля для нормализации уровня экспрессии генов. Далее центрифуга пластины в 1109 раз тяжести в течение трех минут. Затем храните пластину, защищенную от света при четырех градусах цельсия, до начала эксперимента.
Для выполнения ПЦР в режиме реального времени поместите образцы в машину. Затем установите профиль теплового цикла с первоначальным циклом горячего старта на уровне 50 градусов по Цельсию в течение двух минут и 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем 40 циклов при 95 градусах По Цельсию в течение 15 секунд и заключительный цикл при 60 градусах По Цельсию в течение одной минуты. Для анализа уровня экспрессии генов нормализуйте уровни экспрессии генов с помощью метода сравнительного порога цикла, используя ген ACTB в качестве эндогенного контроля.
Оцените уровни экспрессии генов с помощью метода порога сравнительного цикла и навеяйте результаты. Затем выполните статистический анализ с помощью студенческого t-теста, учитывая статистически значимые результаты с
Ядерное выражение OTX1 было обнаружено во всех образцах аденокарциномы неквишечных типов, в то время как мало или отсутствующий иммунореактивность была выделена в аденокарциномах кишечного типа. Интенсивная иммунореактивность присутствовала во всех обонятельных нейробластомах. Среди всех плохо дифференцированных нейро-эндокринных карцином, выражение OTX варьировалось по интенсивности и проценту положительных клеток.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы выполнить каждый шаг извлечения РНК в стерильных условиях, используя также стерильное оборудование. Параллельно с этой процедурой, другие методы, такие как рентгеновский анализ, эндоскопический осмотр полости носа, КТ, магнитно-резонансная томография, и биопсия, могут быть выполнены для того, чтобы подтвердить результаты, полученные из нашей техники. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области онкологии, чтобы исследовать это заболевание в клеточных моделях.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как определить молекулярные маркеры для распознавания подтипов опухоли с помощью иммуногистохимии и ПЦР в режиме реального времени. Не забывайте, что работа с этими реагентами, приборами и образцами может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ДОИ, всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
