Bu deneyin genel amacı basit ve verimli bir şekilde sinonazal karsinomlar ve koku nöroblastomlar için yararlı moleküler belirteçleri belirlemektir. Bu yöntem koku nöroblastomu ve sinonazal karsinom alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir, tümör alt tipi ayırt etmek için moleküler belirteçlerin belirlenmesi gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, altı saatten az bir sürede veya hastane raporu için bir gün içinde sonuç elde edebilmektir.
RNA çıkarma ve gerçek zamanlı PCR prosedürünü gösteren Dr.Giorgia Millefanti, benim laboratuvar bir doktora öğrencisi olacaktır. Ve immünohistokimya prosedürünü gösteren Giovanni Micheloni, aynı zamanda benim laboratuvardan doktora öğrencisi olacak. İşleme başlamak için, baş ve boyun tümörlerinin WHO sınıflandırmasına göre, tüm insan FFPE örneklerini farklı alt gruplara ayırın ve bölün.
Numuneleri 60 derecede 30 dakika boyunca ısıtın. Daha sonra, üç mikrometre kalınlığındaki FFPE kesitlerini ksilenin içinde 10 dakika boyunca kısa bir süre yıkayarak yeniden sulayın. Daha sonra, her yıkamada beş dakika boyunca slaytları %100 %95 %85 ve %75 alkolle seri olarak yıkayın.
Damıtılmış suda beş dakika slaytları durulayın. Daha sonra, 12 dakika boyunca% 3 sulu hidrojen peroksit slaytlar yerleştirerek endojen aktiviteyi engelleyin. Daha sonra, 10 milimolar sitrat tampon uğrunda slaytları tedavi ederek ve 10 dakika boyunca mikrowaving ile antijen alma gerçekleştirin.
10 dakika sonra, TBS tampon bölümleri yıkayın. Sonra, Triton X% 0.2 ekleyin ve keçi anti-insan OTX2 Antikor ile, dört derece santigrat gecede tüplü, 1 ila 100 oranında seyreltilmiş. Ertesi gün, 1 ila 200 seyreltilmiş biyotinylated tavşan anti-keçi ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bölümleri kuluçka.
Daha sonra örnekleri ABC peroksidaz kompleksi ile tedavi edin. Daha sonra, diaminobenzen tetrahidroklorür kullanarak immünreaksiyon geliştirmek, ve harris hematoksilin ile çekirdekleri karşı leke. Daha sonra, hilal alkol ölçeğinde bölümleri dehydrate ve turpine kökenli bir temizleme maddesi onları açıklığa kavuşturmak.
Daha sonra, bölümleri montaj ortamına sahip bir slayta monte edin. RNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyondan sonra, sonda tabanlı teknoloji ve termal döngücü ile nicel gerçek zamanlı PCR analizi yapın. 12,5 mikrolitre prob bazlı ana karışım, her OTX1, OTX2 ve ACTB problarının 1,25 mikrolitresi, 50 nanogram CDNA ve toplam hacmi25 mikrolitreye kadar çekirdeksiz su kullanarak PCR reaksiyon karışımını hazırlayın.
Gen ekspresyonu düzeylerini normalleştirmek için endojen kontrol olarak ACTB genini kullanarak triplicate tüm reaksiyonları gerçekleştirin. Sonra, 1109 kez yerçekimi üç dakika için plaka santrifüj. Daha sonra plakayı ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın, ta ki deneye kadar.
Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için, örnekleri makineye yerleştirin. Daha sonra, termal döngücü profilini iki dakika için 50 derece santigrat derece, 10 dakika 95 santigrat derece, ardından 95 santigrat derece de 40 döngüleri 15 saniye ve bir dakika için 60 derece santigrat son döngüsü ile ayarlayın. Gen ekspresyonu düzeyi analizi için, endojen kontrol olarak ACTB genini kullanarak karşılaştırmalı döngü eşik yöntemi ile gen ekspresyonu düzeylerini normalleştirin.
Karşılaştırmalı döngü eşiği yöntemini kullanarak gen ekspresyonu düzeylerini değerlendirin ve sonuçları çizin. Daha sonra, p ile istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar göz önünde bulundurularak, öğrencinin t-testini kullanarak istatistiksel analiz yapın
OTX1 için nükleer ekspresyon tüm non-intestinal tip adenokarsinom örneklerinde bulundu, çok az veya immünreaktivite olmayan bağırsak tipi adenokarsinomlarda vurgulandı. Tüm koku nöroblastomlarında yoğun immünoreaktivite mevcuttu. Tüm kötü diferansiye nöro-endokrin karsinomlar arasında, OTX ekspresyonu pozitif hücrelerin yoğunluğu ve yüzdesi olarak değişmektedir.
Bu yordamı denerken, steril ekipmanlar kullanarak steril koşullarda RNA ekstraksiyonunun her bir adımını gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedüre paralel olarak, tekniğimizden elde edilen sonuçları doğrulamak için x-Ray analizi, burun boşluğunun endoskopik muayenesi, CT taraması, manyetik rezonans görüntüleme ve biyopsi gibi diğer yöntemler de uygulanmaktadır. Bu teknik, gelişiminden sonra onkoloji alanında araştırmacıların bu hastalığı hücre modellerinde keşfetmelerinin önünü açmıştır.
Bu videoyu izledikten sonra, immünohistokimya ve gerçek zamanlı PCR kullanarak tümör alt tiplerini ayırt etmek için moleküler belirteçleri tanımlamak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bu reaktiflerle, enstrümantasyonla ve numunelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken DPI gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
