原人类单核细胞的隔离、转染和文化

HIV 感染导致免疫功能障碍，即使在接受抗逆转录病毒治疗的个人中，也未发现病毒。这种方法允许研究单细胞功能，这是免疫反应的关键调节器。我们优化了这种技术，用于人类原发单核细胞的分离、培养和转染。

我们使用这种方法来了解HIV感染者免疫功能障碍的分子机制，但它可以应用于涉及单核细胞的任何其他免疫研究。如果这是你第一次使用人类血液，请记住遵循正确的生物安全协议，并处理所有样品作为可能感染性物质。在四个10毫升EDTA真空管中收集40毫升新鲜人类全血后，使用无菌技术将所有血液转移到生物安全柜中的单个50毫升锥形丙烯管中。

按照制造商从选定的人类单细胞分离试剂盒的指示，将两毫升单核细胞分离鸡尾酒从试剂盒添加到血管中，然后从试剂盒中旋转磁珠 30 秒。在血液中加入两毫升珠子，并使用 25 毫升血清移液器小心地将珠子与血液混合。在室温下五分钟后，将血液平均分割在四个50毫升管之间，并添加30毫升无菌PBS，并辅以一毫摩尔EDTA。

再次与塑料 25 毫升血清移液器混合，将管子放在磁性支架中。10分钟后，使用移液器从每个管的中心绘制内容物，注意不要吸气超过一毫升红血球，并分配管内物到四个新的50毫升管之一。将涡旋磁珠的500微升加入每个管中，轻轻混合细胞溶液。

将管子放回磁架5分钟，然后小心地将内装物从每个管的中心转移到四个新的50毫升管中。当所有细胞悬浮液都转移后，将每个新的50毫升管放入磁体支架5分钟，然后小心地将管内板转移到第三组四个新的50毫升管中。然后通过离心收集细胞，并在总共10毫升无菌PBS中重新供应所有四个细胞颗粒进行计数。

计数后，将分离的单核细胞以每毫升10倍至6个细胞的37摄氏度无血清RPMI 1640介质补充抗生素，将一毫升再增的细胞重新放入生物安全柜中的35毫米板中。然后将板放在细胞培养箱中30至60分钟，使细胞粘附在井底。为了使用M1样表型的巨噬细胞，在每个盘子里加入100微升的胎儿牛血清，每毫升GM-CSF含有25毫微克。

为了使用M2样表型的巨噬细胞，向每个板中加入100微升的胎儿牛，每毫升M-CSF含有50毫微克。对于具有微RNA模拟、抑制剂或小干扰RNA的单细胞转染，按照制造商关于转染试剂盒的协议，将缓冲液中选定的RNA稀释至10微升的最终浓度为1.83微摩尔，其中10微升稀释的模拟或抑制剂的转染量为10倍至第五细胞体积。要准备转染试剂，在1.5毫升微离心管中加入一微升聚合物，并立即加入90微升试剂盒提供的缓冲液，每转染获得91微升试剂。

涡流摄政3至5秒，移液器90微升的转染溶液进入管内含有10微升稀释RNA。轻轻混合后，在室温下孵育溶液15分钟，然后向一个细胞井中加入100微升的转染复合物。在37摄氏度下4小时后，用含有适当生长因子的三毫升完全介质代替该介质。

在培养的第六天，用三毫升的培养剂代替来自M1培养物的培养剂，补充胎儿牛血清、抗生素、脂质多糖和干扰素伽马，用中辅胎儿牛血清、抗生素、M-CSF和白细胞-4取代M2培养物的超级天然剂。培养24小时后，每次洗涤用新鲜PBS洗涤每盘活性巨噬细胞两次。对于RNA和蛋白质分析，将附着的细胞直接在板中，以便收集释放的细胞内容进行分析。

对于流式细胞测量分析，在37摄氏度下用PBS中两毫摩尔EDTA分离细胞10分钟，然后轻轻地从板底刮取细胞，以便将其收集到1.5毫升微离心管中进行分析。这里显示了M1-激活对照组和患者衍生细胞的代表性直方图，与非激活的T0细胞相比，CD80和CD83和M2激活细胞水平增加。有趣的是，CD80和CD83在控制源细胞中表达比HIV衍生细胞更强烈。

新鲜收集的单核细胞的转染与炒近红外标记的微RNA产生超过90%的转染效率，由流式细胞学和共物显微镜确定。此外，无论细胞成熟阶段或转染条件如何，转染不会显著降低患者衍生细胞或对照细胞的生存能力。转染导致在分离后的第一天和第四天，通过特定的小干扰RNA对转染时的目标基因进行有效的降低调节。

此外，通过微RNA模拟转染的细胞表明，与未转染的细胞的微RNA表达增加48至72倍，而所有转染对等控制都无明显变化。镀的细胞数量对生存至关重要。我们每35毫米培养皿推荐100万个细胞。

在无血清介质中电镀也会大大改善细胞附着。使用这种方法获得的细胞可以使用细胞因子或生长因子进行治疗，以研究患者与健康对等患者的不同反应。