此方法可以帮助回答中点场中的关键问题，例如将蛋白质本地化到中周特定区域。这种技术的主要优点是，我们提供集中中心器，使它们在多个方向。虽然这种方法可以提供对衣原体中心生物学的见解，它也可以应用于其他系统，如孤立的人类和半中心。
展示这个程序的将是博士生尼古拉·克莱纳，另一位博士生马埃瓦·勒·盖内茨，以及实验室的博士后大卫·甘巴罗托。要开始此过程，请首先准备文本协议中概述的所有媒体和文化 C.Reinhardtii 单元格。将准备好的细胞转移到50毫升锥形管中，并在600次g下离心10分钟。
用 50 毫升 1x PBS 洗涤颗粒一次，以 600 倍 g 再次旋转细胞 10 分钟。使用移液器将颗粒重新在 100 毫升室温除火缓冲液中重新排液。将烧杯放在磁搅拌器上，缓慢地将0.5摩尔醋酸加入4.5至4.7的最终pH。
让这种混合物在室温下孵育两分钟。在此缓慢添加一滴正常的氢氧化钾以将pH值恢复到7.0后，将细胞转移到50毫升管中，并在600倍g下离心10分钟，以去除任何分离的旗杆。丢弃上一液，将颗粒储存在冰上，直到准备清洗。
准备好后，使用 50 毫升 1x PBS 洗涤颗粒两次，每次洗涤温度为 4 摄氏度。在 600 倍 g 和 4 摄氏度下旋转洗涤颗粒 10 分钟。将颗粒在 30 毫升 1x PBS 中重新暂停。
然后，缓慢地将悬浮液装到 25% 蔗糖的 20 毫升缓冲上，无需混合。在 600 倍 g 和 4 摄氏度下旋转 15 分钟，以去除剩余的旗杆菌，并在蔗糖中扩散细胞。使用吸气器，小心吸气的上清液只保持最底部的20毫升。
加入20毫升冷1xPBS，清洗剩余的蔗糖。在600倍g和4摄氏度的离心机10分钟。在4摄氏度下将颗粒重新在10毫升1x PBS中，确保溶液中没有团块。
将重新暂停的颗粒转移到一个新的250毫升的瓶子中，将含有细胞的瓶中加入与5000个单位的DNase补充的解液缓冲液。在4摄氏度下孵育1小时，同时每15分钟混合一次，小心地倒置瓶子。将开水电池转移到50毫升锥形管中，在600倍g和4摄氏度的温度下离心10分钟。
使用移液器，收集上清液，并加载到含有两毫升60%蔗糖垫的冰上30毫升圆底管。在摄氏4度下以1万倍g离心30分钟。在此之后，吸上经剂高达一毫升以上的蔗糖垫。
请注意剩余上一升的黄色界面和两毫升蔗糖垫之间的黄色界面。使用切割 P1000 尖端，将剩余的上一液与蔗糖轻轻混合。将所有的蔗糖垫池水，并存放在冰上。
接下来，在薄壁38.5毫升聚丙烯管中准备40%至70%的蔗糖梯度，如文本协议中所述。缓慢地将池接口加载到渐变中。平衡管与10毫摩尔K-PIPES缓冲液，离心机在68，320倍g和4摄氏度75分钟。
在此之后，使用0.8毫米的针在管的底部打一个洞，确保不打扰不同的蔗糖层。使用此孔在 4 摄氏度下收集 12 500 微升分数。使用切割的 P200 尖端，从每个分数中再准备 10 微升等分，用于免疫荧光。
然后，捕捉冻结液氮中的分数。首先，将无菌的 12 毫米盖玻片放在集中器的凹陷底端，确保将 PDL 涂层的侧向下。将适配器直接放在顶部，以盖住盖玻片。
然后，反转圆底管，并放在集中器、盖玻片和适配器上。使用钳子，轻轻推动合奏，直到它到达管的底部，然后反转管。添加 10 毫摩尔的 K-PIPES 缓冲液，直到到达集中器的顶部。
确保集中器的中央气缸中没有气泡。轻轻将 100 微升 10 毫摩尔 K-PIPES 缓冲液添加到富集的中点分数的一个等分中，并使用 P200 移液器彻底混合。接下来，从集中器的空心中心取出100微升的K-PIPES缓冲器，并加入100微升的缓冲液馏分混合物，确保内装物留在集中器的空心中心。
在预冷到摄氏4度的离心机中，以10，000次g旋转10分钟。在此之后，使用钳子取出集中器。将手工挂钩的设备插入适配器开槽边缘的孔中，然后轻轻抬起以恢复盖玻片。
一旦它到达管子的顶部，用戴手套的手指捕获适配器的边缘，并使用钳子去除盖玻片，注意盖玻片的哪一侧包含中心。然后，对集中的中心进行固定和免疫荧光染色。首先，在零下20摄氏度下用 prepared准备的晶体聚苯乙烯传输实验室盒中装满100%甲醇的中流塞孵育盖玻片5分钟。
使用钳子，将盖玻片转移到一个透明实验室盒中，里面装满了 50 毫升 1x PBS。让幻灯片在 PBS 中洗涤五分钟，在室温下。然后，移液器60微升原抗体混合到加湿室的实验室密封包装上。
小心地将盖玻片放在抗体混合物的顶部，与正对跌落的中心。让盖玻片孵育45分钟。在此之后，取出盖玻片，并在包含 PBS 的盒子里清洗五分钟。
孵育洗涤盖玻片45分钟，在PBS 1%BSA和0.05%Tween-20中产生继发抗体。取下盖玻片，在装有 PBS 的盒子里清洗五分钟。使用常规防褪色安装介质，将盖玻片安装到幻灯片上。
然后，在 63X 油目标上以 N.A.1.4 对共和显微镜上对分离的百分镜进行成像，同时应用去卷积。分别设置 Z 堆栈顶部和底部位置，并获取包含总中心信号的大量图像。按文本协议中概述的表示堆栈并执行单粒子平均。
具有代表性的免疫荧光显示，分离的中流图丰富了六个分数，分数为三，而最后两个分数没有，表明纯化是成功的。没有集中器，每个视野只看到大约 30 美分，而 183 个用集中器看到。这表明集中器步骤是成功的，并允许在定义的区域中将中心值丰富六倍，从而更容易检测和成像它们。
然后，超分辨率显微镜用于成像沾染的单糖基化管状图林的中点，软件用于为每种选择的方向生成近乎完美的平均值。经过五次迭代后，产生了两类单糖基化中流图：63个物体的顶视图和98个粒子的侧视图。侧视图类的平均长度为 260 纳米，直径为 250 纳米，与在中心核心内显示的测量的单胶基化浴缸信号相当。
执行此程序时，重要的是要记住将隔离的中流块留在冰上，并在隔离后捕捉冻结它们。按照这个程序，其他方法，如低温电子显微镜和质谱法可以执行，以回答额外的问题，如中流体或中角蛋白组合物的原生结构。
